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本研究以牛的去透明带体细胞核移植为主题,比较了牛卵母细胞的不同成熟培养方法;分离并传代培养了牛耳成纤维体细胞:研究了牛体细胞核移植过程的去核方法、融合条件等对重构胚发育的影响,旨在探索一种简化的核移植操作程序。
1.以抽吸法采集了屠宰母牛卵巢卵母细胞,并重点探讨了添加不同种类及不同剂量激素的培养系统对牛卵母细胞成熟率的影响,即PMSG、HCG、FSH、LH对卵母细胞IVM的影响,在成熟培养液内添加这几类激素可以促进卵母细胞的体外成熟,最高成熟率为81.7％。
2.不同成熟培养时间对极体排出率和附着率的影响:成熟培养18-19h,20-21h,23-24h时,极体排出率分别为76.1％,81.7％,82.2％。消化透明带后,在成熟培养18-19h,20-21h,23-24h时,极体附着率分别为77.2％、64.1％,41.3％。结果表明,成熟培养20-21h后去除透明带处理,其极体排出和附着效果最佳。
3.去核效果的比较:采用半卵法和盲切法作对比,结果显示半卵法去核率高于盲切法,借助荧光染色达到100％,但所用时间长,去核效率不如盲切法高。
4.融合条件的优化:在脉冲宽度为40μs、2次脉冲、间隔1s的条件下,分别采用2.4Kv/cm、2.6Kv/cm、2.8Kv/cm直流电压融合去核卵母细胞与成纤维细胞。融合率分别为77.55％,93.96％,68.98％,各组间差异显著。结果表明,融合电压为2.6Kv/cm时效果最好。
5.化学融合的探索:浓度为40％、45％、50％的PEG均可引起细胞融合。其中浓度为50％时,其融合率最高,达53.33％。
6.重构胚的激活和发育:去核的去透明带卵母细胞-体细胞融合后,分别采用乙醇+6-DMAP和离子霉素+6-DMAP两种方法激活,激活后重构胚在压制的WOWs内进行培养。用乙醇激活时,采用半卵法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别61.2％和3.27％,盲切法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别是70.8％和7.56％;用离子霉素激活时,两种方法处理的卵裂率和8-细胞发育率分别为46.5％,0和56.1％,3.12％。结果显示用乙醇+6-DMAP的方法重构胚的卵裂率高于离子霉素+6-DMAP激活,且盲切法去核重构胚的卵裂率高于半卵法。以上研究表明,通过去透明带辅助显微操作去核的方法进行的牛体细胞克隆,相对于传统克隆程序易于掌握,是一种较为简便的操作程序,但去透明带后的重构胚体外发育系统有待进一步完善。
1.以抽吸法采集了屠宰母牛卵巢卵母细胞,并重点探讨了添加不同种类及不同剂量激素的培养系统对牛卵母细胞成熟率的影响,即PMSG、HCG、FSH、LH对卵母细胞IVM的影响,在成熟培养液内添加这几类激素可以促进卵母细胞的体外成熟,最高成熟率为81.7％。
2.不同成熟培养时间对极体排出率和附着率的影响:成熟培养18-19h,20-21h,23-24h时,极体排出率分别为76.1％,81.7％,82.2％。消化透明带后,在成熟培养18-19h,20-21h,23-24h时,极体附着率分别为77.2％、64.1％,41.3％。结果表明,成熟培养20-21h后去除透明带处理,其极体排出和附着效果最佳。
3.去核效果的比较:采用半卵法和盲切法作对比,结果显示半卵法去核率高于盲切法,借助荧光染色达到100％,但所用时间长,去核效率不如盲切法高。
4.融合条件的优化:在脉冲宽度为40μs、2次脉冲、间隔1s的条件下,分别采用2.4Kv/cm、2.6Kv/cm、2.8Kv/cm直流电压融合去核卵母细胞与成纤维细胞。融合率分别为77.55％,93.96％,68.98％,各组间差异显著。结果表明,融合电压为2.6Kv/cm时效果最好。
5.化学融合的探索:浓度为40％、45％、50％的PEG均可引起细胞融合。其中浓度为50％时,其融合率最高,达53.33％。
6.重构胚的激活和发育:去核的去透明带卵母细胞-体细胞融合后,分别采用乙醇+6-DMAP和离子霉素+6-DMAP两种方法激活,激活后重构胚在压制的WOWs内进行培养。用乙醇激活时,采用半卵法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别61.2％和3.27％,盲切法去核的卵裂率和8-细胞发育率分别是70.8％和7.56％;用离子霉素激活时,两种方法处理的卵裂率和8-细胞发育率分别为46.5％,0和56.1％,3.12％。结果显示用乙醇+6-DMAP的方法重构胚的卵裂率高于离子霉素+6-DMAP激活,且盲切法去核重构胚的卵裂率高于半卵法。以上研究表明,通过去透明带辅助显微操作去核的方法进行的牛体细胞克隆,相对于传统克隆程序易于掌握,是一种较为简便的操作程序,但去透明带后的重构胚体外发育系统有待进一步完善。