FoxM1核酸探针的构建及应用

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核酸探针,是指能够与特定的靶分子发生特异性的相互作用,并被特定方法探知的分子,是一种可以从分子水平上进行设计、合成以及应用的新兴研究手段,为推动分子生物学和分子医学的发展起了重要的作用。本论文以ForkheadBox(Fox)转录因子家族中的FoxM1为靶标,建立了一套筛选能够特异性、高亲和力靶定转录因子FoxM1的核酸适配体(aptamer)的SELEX(指数富集配体进化技术)体系,并对筛选得到的核酸适配体与靶物质的特异性与亲和力进行了验证。在此基础上,构建了一种利用分子信标(MB)简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。主要工作如下:1.建立了一套筛选特定蛋白的SELEX技术方法。运用已构建正确的PGEX-4T-1-GST-FoxM1-220-335以及PGEX-4T1-GST质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了GST-FoxM1-220-335融合蛋白及其GST蛋白,经过八轮体外筛选得到了四条核酸适配体。2.对筛选得到的核酸适配体对靶物质的其特异性与亲和力进行了验证。经荧光检测、核酸凝胶阻滞实验(EMSA)和免疫共沉淀实验(co-ip)等证实筛选得到的核酸适配体能够特异性、高亲和力的靶定转录因子FoxM1。3.基于微球富集技术,利用筛选得到的核酸适配体在体外检测GST-FoxM1-220-335。4.在附录B中,我们建立了一种利用分子信标简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。分子信标(MB)被用来检测模拟的HCV-RNA酶切产物,检测下限为0.02nmol/L。
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