胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是从囊胚内细胞团中分离培养的细胞,可以在体外无限自我更新,并具有分化为体内多种类型细胞的潜能。目前,ES建系技术以小鼠的最为成熟。而从严格意义上讲,猪ES还没有被建立起来,其中猪内细胞团细胞培养过程中的自发分化是重要的限制性因素之一。因此要建立猪ES细胞系首先要解决分化问题,需要发现猪特异的维持全能性或多能性的关键基因以及细胞信号调控通路。根据小鼠、人以及大鼠ES和iPS的研究进展,我们推断猪ES建系的研究需要从某几个关键因子入手,因此,作为这一假设的探索性工作,本研究将目标设定为近几年在其它物种上新发现的与维持多能性相关的因子Sa114和Lin28上。本研究克隆了猪源Sa114和Lin28基因,比对了它们在物种间的同源性。通过分析Sa114在猪各组织及早期胚胎中的表达情况,初步研究了它在猪早期胚胎发育和分化中的功能。将Lin28基因转染猪胎儿成纤维细胞,获得了过表达Lin28基因的细胞系,通过检测该细胞系中其他多能因子的表达情况,初步探索了猪Lin28基因与Oct4等多能基因间的调控关系。研究的主要结果如下:1)通过RT-PCR及RACE的方法从猪卵巢组织总RNA中克隆了猪Sa114b基因的cDNA全长,经NCBI工具ORF finder分析,得到1851bp的编码区,编码含有616个氨基酸的多肽链;SMART分析结果表明,其蛋白含有三个ZnF_C2H2锌指结构域(分别在72-92aa,432-454aa和460-482aa位置):序列已上传至GenBank,登陆号为:JQ773336。2)通过Real-time PCR方法检测了新生猪各个组织器官和猪早期胚胎的各个发育阶段中Sall4b基因表达情况。表明Sall4基因广泛表达于猪的各种器官,其中卵巢的表达量最高,脾、肺、心和精巢的表达量次之。这与之前小鼠的研究结果:Sa114b基因仅在卵巢和精巢中高量表达,在肾脏、肠、脾脏、胃、胸腺、肝脏、皮肤中不表达或表达量极低的结果类似。sall4b基因在猪各阶段体外受精胚胎中的表达情况有明显的变化趋势,它的表达量在合子至4-细胞阶段逐渐降低,随后又逐渐升高,囊胚阶段到达表达最高峰。3)通过免疫荧光方法跟踪Sa114b在猪早期胚胎中的表达情况,结果表明Sa114b在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,随着胚胎发育的进行,胚胎内部细胞的表达量高于外部细胞,到囊胚阶段,该基因的表达定位在内细胞团中。4)通过RT-PCR的方法从猪桑葚胚总RNA中克隆了猪Lin28基因的cDNA全长,序列分析表明该段基因由618个碱基组成,与NCBI上提交的序列完全一致。5)成功构建了逆转率病毒载体pMXs-Lin28,用pMXs-Lin28包装出高效价的逆转录病毒,成功感染PEF细胞,感染效率达到90%以上,在被感染的细胞中,Lin28RNA的表达量提高了 14倍,免疫荧光检测证实了 Lin28蛋白在PEF细胞中的表达。6)在Lin28过表达的PEF中,Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog的表达量均有明显的升高。在所检测的基因中,Lin28对Nanog的影响最大,使Nanog的表达水平提升了 10余倍;对Klf4和c-Myc的影响次之,使它们的表达水平都提高了 5倍左右;对Oct4和Sox2的影响最小,仅仅使它的表达水平升高了 3倍左右。Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog都是在重编程过程中十分重要的因子,表明Lin28可能是猪Ips诱导中的一个非常重要的因子。