消化系统(digestive system)由两大部分组成分别是:消化道和消化腺。人体的消化管由口腔、咽、食道、胃、小肠和大肠等部分组成。临床上常把口腔到十二指肠的这一段称上消化道,空肠以下的部分称下消化道。消化腺有小消化腺(散在于消化管各部的管壁内)和大消化腺(腮腺、下颌下腺、舌下腺)、肝和胰)两种。消化系统是人体九大系统之一。口腔是消化道的起始部分。前借口裂与外界相通,后经咽峡与咽相续。口腔癌是发生在我们正常人体组织中较常见的恶性肿瘤之一,世界卫生组织统计结果显示:口腔癌发病率在人类可知的恶性肿瘤中排名第六位,局部复发率比较高所以预后比较差。口腔恶性肿瘤90%以上为癌,以鳞状细胞癌最为常见,可以是在口腔原发,也可由远处组织转移至骨或邻近结构,或者是原发于邻近组织的病灶侵犯口内而表现于口腔组织。口腔鳞状细胞癌的危险因素多种多样,其中包括物理致癌因素、化学致癌物、生物致癌因素、遗传、机体易感性和种族等多种因素。研究证明,单一因素并不能引发口腔鳞状细胞癌。口腔鳞状细胞癌极可能是内因和外因在较长时间内联合作用而导致的一个复杂过程。口腔鳞状细胞癌的一个重要的特点常常伴有颈部的淋巴转移,有16%-55%的患者伴有颈部淋巴结转移,大量的研究表明,口腔癌患者如果伴有同侧或对侧单个颈淋巴转移,患者术后的生存率低于50%。所以口腔鳞状细胞癌患者术前是否伴有颈部淋巴结转移对于患者手术方案的制定及病情预后的判断具有十分重要的意义。恶性肿瘤的侵袭与转移是导致口腔鳞状细胞癌患者预后差及复发率高的主要原因。我们还无法通过恶性肿瘤发生部位的解剖结构及固定血流、淋巴引流等机制来解释恶性肿瘤的侵袭和转移。现代医学对恶性肿瘤的远处转移的理解可以解释为以下几个层次:首先,恶性肿瘤的生物学特征时具有异质性。第二,为了适宜侵袭表型的肿瘤细胞亚群生长的稳定内环境,恶性肿瘤的转移具有高度选择性的复杂过程往往具有。最后,侵袭细胞与内环境的相互作用决定者恶性肿瘤转移的产生与否,恶性肿瘤细胞通过掠夺机体内环境中的资源,较正常机体细胞有生长繁殖的优势。癌细胞的一个十分重要的特点就是:逃避失巢凋亡或脱落诱导的细胞凋亡。失巢凋亡是通过癌细胞在不适当的地方生存被允许,并可以通过人体传播,这个关键点成为一个治疗癌症的关键障碍。因此,一个重要的遏制恶性肿瘤细胞侵袭及向周边及远处转移的治疗策略是恢复癌细胞诱导失巢凋亡的敏感性。Bit-l基因是于2004年研究人员发现的一个新基因。其被命名为Bit-l(Bcl-2inhibitor of transcription 1)是因为Bit-1具有下调Bcl-2表达的功能。通过研究人员的不断努力,目前认为Bit-l是一个很关键的可以促进凋亡的因子并且它是由整合素(integrin)诱导产生的,bit-1介导的离巢凋亡是通过细胞脱粘附实现的。离巢凋亡发生的一个重要途径就是整合素介导的细胞粘附。通过细胞之间的脱粘附所产生的离巢凋亡在各种各样的细胞中均已经被发现,比如神经原细胞、肠上皮细胞、肾细胞和前列腺上皮细胞等。通过各个领域的学者研究表明,整合素是通过其本身的一些受体蛋白来调节调节上皮细胞从而诱发细胞凋亡现象的发生。整合素是通过使上皮细胞维持在长时间的悬浮状态,或者是用短肽封闭从而达到破坏上皮细胞与ECM之间原有的相互作用现象,即可诱导细胞凋亡现象的发生发展。最新的相关研究表明,只有细胞与ECM接触后,才可以发生阻碍细胞凋亡现象的发生,而整合素受体蛋白是通过其诱发的信号传导途经来实现的。通过大量的研究实验表明,Bit-l从细菌及人体组织角度来讲都具有保守性高的特点,大量的实验研究证明,Bit-1在人体的睾丸、前列腺、骨骼肌及肝脏内与正常组织相比较具有高表达性,与此同时一些学者在人体心脏、脾、胎盘及结肠内也可以检测的到Bit-1的表达,但是在人体胸腺内几乎检测不到Bit-1的表达,同样人的外周血白细胞中也几乎检测不到Bit-1的表达。Bit-1是一个由179个残基和线粒体蛋白质用来监管以前未知的细胞凋亡途径的一部分通过整合素介导的细胞附着。Bit-1是一个通过整合素来调控及促进细胞凋亡的蛋白质,先前的研究发现Bit-l蛋白在正常的生理状态处在于细胞线粒体膜间隙内,当Bit-l蛋白释放到细胞浆内,并且与AES(amino-terminal enhancer of split)结合形成一个复合体,这个Bit-1-AES复合体诱导了由于细胞脱粘附诱发的离巢凋亡。细胞浆内含有Bit-l的浓度越高,我们可以观到的细胞凋亡的发生现象就越多,而组织当中含有Bit-1的浓度越低,细胞凋亡发生的情况就越少。上述研究结果显示,Bit-l蛋白与细胞凋亡发生发展有着密切的关系,而且是调节细胞凋亡的一个新分子,因此,对这种具有决定细胞凋亡的线粒体蛋白进行全方位的研究,有利于我们认识清楚癌细胞凋亡的发生的机制和调控的方式,并且对于口腔癌的治疗具有重要的临床治疗意义。我们的研究的目的是通过分析Bit-1蛋白在人口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113中的表达情况及转移侵袭等生物学行为,并探讨其发生发展的机制,从而为口腔鳞状细胞癌的治疗及预防提供一个新的方案及思路。我们的课题组包括以下三个部分:(一)口腔鳞状细胞癌中Bit-1m RNA和蛋白的表达及其临床意义方法:为了探索Bit-l与口腔鳞状细胞癌的关系,我们应用了逆转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)及免疫组织化学法(Immunohistochemistry)对口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌旁不典型增生组织及口腔正常黏膜组织中Bit-l的表达水平进行检测,从而探讨和研究Bit-1基因及蛋白的表达与口腔鳞状细胞癌的相关性。1.首先采用RT-PCR方法检测75例口腔鳞状细胞癌组织(其中有25例患者发生淋巴结转移)及其口腔鳞状细胞癌癌旁组织、口腔黏膜正常组织中Bit-l m RNA表达。2.其次本研究采用免疫组织化学(S-P法)检测75例口腔鳞状细胞癌其中25例发生淋巴结转移、25例口腔鳞状细胞癌癌旁组织及25例正常口腔黏膜组织标本中Bit-l蛋白的表达。实验结果:1.Bit-I m RNA在口腔鳞状细胞癌组织中的表达Bit-l m RNA口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜组织中的含量依次为0.879±0.136,0.514±0.093,0.438±0.071。Bit-l m RNA在人类口腔鳞状细胞癌组织中的表达水平较口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜组织(均P<0.05)均高,而其在口腔鳞状细胞癌癌旁组织及正常口腔黏膜中的表达无显著性差异。2.Bit-l m RNA的表达与临床病理学参数的关系统计学结果表明,在口腔鳞状细胞癌组织中,Bit-1的表达水平与患者的年龄、性别无明显相关(P>0.05),但Bit-l基因的表达在有淋巴结转移组中明显高于无淋巴结转移组,两组间比较有统计学意义。而且在TNM分期中III/IV期组表达水平明显高于I/II期组,并且具有统计学意义(P<0.05)。3.Bit-l蛋白在口腔黏膜组织中的表达通过免疫组化实验检测Bit-1在口腔鳞状细胞癌原发灶及正常口腔黏膜的表达情况。Bit-1主要表达于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜,在正常口腔黏膜中均呈低染色或不染色。我们的实验结果显示:在75例口腔鳞状细胞癌原发灶中阳性表达54例(72%),而在25例正常口腔黏膜阳性表达仅2例(8%),统计分析表明Bit-1在两组间表达具有显著性差异(P<0.05)。4.Bit-l蛋白的表达与临床病理学参数的关系结合标本的病理学诊断、HE染色结果及手术记录,对所有标本按照分化程度、性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等进行分类,并进行统计学分析结果表明:在Ⅰ-Ⅱ期的口腔鳞状细胞癌原发灶的Bit-1阳性表达24例(24/40),而Ⅲ-Ⅳ期口腔鳞状细胞癌原发灶Bit-1阳性表达30例(30/35),明显高于前者的表达,两组比较有统计学意义。伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1阳性表达21例(21/25),不伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1阳性表达33例(33/50),伴有淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌组织中Bit-1的表达明显高于不伴有淋巴结转移组的表达,两组间有统计学意义(P<0.05)。统计分析结果显示:Bit-1表达与口腔鳞状细胞癌的TNM分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、肿瘤大小,分化程度无明显关系(P>0.05)(二)Bit-1在口腔鳞状细胞癌侵袭和迁移过程中的作用方法:首先为了进行细胞转染,我们通过实验方法构建了p CMV-Myc-bit-l和p CMV-Myc-EGFP真核表达载体。为了验证转染的成功率。构建完毕后我们课题组利用RT-PCR及Western Blot方法来检测Bit-1在人鳞状细胞癌Tca 8113基因的表达情况。检测转染后Bit-l基因在转染细胞中的表达情况,转染完毕后,我们将实验细胞分为三组,分别用MTT法检测转染Bit-l基因的Tca 8113细胞的活力情况。然后应用Transwell侵袭小室实验检测转染前后Tca 8113细胞的迁移能力。实验结果:1.RT-PCR及Western Blot检测结果显示未转染及仅仅转染空载体的人鳞状细胞癌Tca 8113中仅有少量的Bit-1基因的高表达。而Tca 8113细胞转染了带有bit-1基因的p CMV-Myc-bit-l真核表达载体后,我们课题组应用RT-PCR及Western Blot的方法检测结果显示转染了Bit-1的口腔鳞状细胞癌的细胞有较明确的基因表达。2.我们的MTT实验检测结果表明,未转染的口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113和p CMV-Myc转染的口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113在实验培养期间,随着培养时间的曾长,成活的癌细胞的数量随着培养时间加长不断增加,经过统计薛分析,二组存活的细胞之间无明显差别,无统计学意义。而将p CMV-Myc-bit-l转染入口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113则在实验培养期间,随着时间的曾长,成活细胞的数目逐渐减少。3.细胞侵袭实验结果Transwell侵袭实验证实,p CMV-Myc-bit-l转染的口腔鳞状细胞癌细胞Tca8113后降低了其侵袭能力。显微镜下拍照,并随机挑选十个不同视野计数,p CMV-Myc-bit-l转染的细胞穿过基底膜的能力较p CMV-Myc转染的细胞和为转染细胞差,穿膜数目依次为:78.43±12.64,69.35±11.38,35.71±6.92。(三)Bit-1在口腔鳞状细胞癌增殖和凋亡的作用研究方法:1.吖啶橙实验准备好转染的三组细胞,我们将术后24h、48h和72h设计为时间点,分别在转染后的三个时间点各取1孔未转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113、p CMV-Myc转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113和p CMV-Myc-bit-l转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113,将三组细胞均制备成单细胞悬液。5ul吖啶橙储存液(0.lml/mg,溶于PBS)加入到95ul细胞悬液,将两组液体混匀后吸1滴混合液滴在载玻片上,放置在荧光显微镜观察并照相。2.DNA片段分析实验在转染后48h分别收集未转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113、p CMV-Myc转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113和p CMV-Myc-Bit-转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113。提取DNA是按照凋亡DNA Ladder试剂盒说明书的方法和步骤进行的。进行1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外照射仪下观察并照相。3.流式细胞实验流式细胞术定量检测转染Bit-l基因的人口腔鳞状细胞癌Tca 8113的凋亡率及细胞周期变化。分别在细胞转染后的三个不同时间点(24h、48h和72h)收集未转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113、p CMV-Myc转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113和p CMV-Myc-bit-l转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113,FCM分析细胞凋亡和细胞周期紊乱情况。4.PI单染检测检测细胞周期未转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113、p CMV-Myc转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113和p CMV-Myc-bit-l转染口腔鳞状细胞癌Tca 8113内的DNA被碘化丙啶染色后,用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定,然后根据DNA含量的分布情况,进行细胞周期和细胞凋亡分析。实验结果:吖啶橙染色观察可以发现典型的细胞凋亡小体染色的现象,DNA Ldader实验也出现了特征的梯形图谱和AFCS分析结果显示Bit-1具有细胞凋亡增加的现象。此外,我们的研究结果AFCS分析显示:三组培养的细胞中随着培养时间的增加,有bit-1转染的口腔鳞状细胞癌Tca 8113中发现了明星的凋亡现象的特征,而未转染bit-1的口腔鳞状细胞癌Tca 8113和仅仅转染空载体的口腔鳞状细胞癌Tca 8113在不同实验培养时间内,可以观察到的凋亡现象很少见。实验结论:综上所述,本课题首先应用RT-PCR及Western Blot技术检测并且分析了人Bit-1蛋白在人口腔鳞状细胞癌中的分布情况,其次较全面的观察到该蛋白在人口腔鳞状细胞癌Tca 8113中转移、增值和凋亡中的作用,为进一步分析Bit-1的作用机制奠定了良好的基础,并有可能为口腔鳞状细胞癌的诊断和治疗提供新的途径和靶分子。