目的:观察慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)肝郁脾虚模型大鼠粪样代谢物变化,及逍遥散(《太平惠民和剂局方》)干预调节机制的研究。方法:45只清洁级SD雄性大鼠,体重180~210 g,适应性喂养1周,随机分为正常组(the control group)、模型组(the stress group)、逍遥散组(the stress+XYS group)3组,每组15只。采用束缚3h、夹尾2 min、热水游泳5 min、倾斜12 h、昼夜颠倒24 h、潮湿垫料24 h、禁食水24 h、噪音3 h、冰水游泳5 min共9种应激原,对模型组和逍遥散组大鼠每天随机进行1~2种应激刺激,同种刺激在48 h内不重复使用,实施应激6周。于每天造模前30 min给大鼠灌胃,逍遥散组灌服逍遥散3.854g/kg/d,正常组和模型组大鼠灌服同等体积的生理盐水。各组大鼠均于实验第0天(day0)、第7天(day7)、第14天(day14)、第21天(day21)、第28天(day28)、第35天(day35)、第42天(day42)进行一般状态观察、摄食量和体重检测、旷场实验、糖水偏好实验。实验结束,采集4 h内大鼠新鲜粪便并称重记录,随后烘干称重,计算大鼠粪便含水率;于取材前1 h灌服5%D-木糖,2%戊巴比妥钠(4 mg/100 g体重)腹腔注射麻醉,断头取血,采用间苯三酚法检测大鼠血清D-木糖含量;于取材前30 min灌服碳末混悬液,麻醉断头后取出全段小肠,测量碳末推进距离和小肠全长,计算小肠碳末推进率;采集大鼠新鲜粪便(>500 mg/粒)置EP管中-80℃保存,采用核磁共振氢谱(~1H Nuclear Magnetic Resonance,~1H NMR)代谢组学技术检测大鼠粪样代谢产物,偏最小二乘法分析方法(Partial least square-discriminant analysis,PLS-DA)进行多元统计分析,比较各组差异代谢物。结果:1.各组大鼠一般状态实验开始前,各组大鼠毛色有光泽,耳廓红润,运动灵活,大便成型干湿适中。造模第1周,模型组大鼠束缚及游泳应激刺激时表现出强烈的反抗、挣扎、嘶叫,抓取易挣脱,毛发竖起,二便增多。实验第2周,模型组大鼠警惕性增强,但束缚时挣扎反抗、嘶叫和挣脱现象减少;实验第3周,模型组大鼠对抗应激的反抗减少,耳廓与爪部颜色逐渐变淡,皮毛光泽度逐渐变差,偶有大便质稀。第4周,模型组大鼠灌胃时反抗减弱,游泳时挣扎、反抗、窜跳减少,束缚时几乎不再挣扎,易被抓取。第5周,模型组大鼠出现反应迟缓、神情倦怠、懒散不喜动,耳廓与爪部颜色变浅淡、光泽度低、毛泛黄易掉落、大便质软。第6周,捉拿模型组大鼠基本无反抗,懒动,多蜷缩于角落,大便多质地稀软。实验初期逍遥散组和模型组大鼠外观及对外界刺激的反应程度无明显差别;第3-5周,逍遥散组大鼠较模型组应激反应和皮毛光泽状态有所改善;直至第6周,逍遥散组大鼠精神状态和活跃程度较模型组改善明显,毛发稍有暗淡但较整洁不易脱落,大便多干湿适中。2.各组大鼠体重和摄食量变化实验前各组大鼠体重、摄食量均无明显统计学差异(P>0.05);应激因素施加后,与正常组比较,模型组大鼠体重增长缓慢,摄食量均呈减少趋势(P<0.01或P<0.05);与模型组比较,逍遥散组大鼠体重和摄食量有所增加,尤其在实验最后2周(day35、day42)逍遥散组增加明显(P<0.05)。3.旷场实验实验第0天各组大鼠旷场实验中5 min移动总路程、中央区5 min移动总路程、中央区5 min总穿格数、中央区5 min停留时间比较均无明显统计学差异(P>0.05)。与正常组比较,实验第7天模型组大鼠5 min移动总路程、中央区5min总穿格数均明显减少(P<0.01或P<0.05),第14天模型组大鼠中央区5 min停留时间明显减少(P<0.05),第21、28、35、42天模型组大鼠5min移动总路程、中央区5 min移动总路程、中央区5 min总穿格数、中央区5 min停留时间均明显减少(P<0.01或P<0.05)。与模型组比较,第21天逍遥散组中央区5 min总穿格数明显增多(P<0.05),第28天逍遥散组中央区5 min停留时间明显增加(P<0.05),第35天逍遥散组中央区5 min总穿格数均明显增加(P<0.01),第42天逍遥散组5 min移动总路程、中央区5 min移动总路程、中央区5 min总穿格数均明显增加(P<0.05)。4.糖水偏好率比较实验第0、7、14天,各组大鼠糖水偏好率无明显统计学差异(P>0.05)。与正常组比较,实验第21、28、35、42天,模型组大鼠糖水偏好率均明显降低(P<0.01);与模型组比较,实验第28、35、42天,逍遥散组糖水偏好率明显上升(P<0.05或P<0.01)。5.粪便含水率比较实验结束,与正常组比较,模型组大鼠粪便含水率明显增加(P<0.05);与模型组比较,逍遥散组粪便含水率明显减少(P<0.05)。6.大鼠血清D-木糖含量比较与正常组比较,模型组大鼠血清D-木糖含量显著下降(P<0.01);与模型组比较,逍遥散组大鼠血清D-木糖含量均显著升高(P<0.01)。7.小肠碳末推进率比较与正常组比较,模型组大鼠小肠碳末推进率明显降低(P<0.05);与模型组比较,逍遥散组碳末推进率虽然有上升趋势,但无明显统计学差异(P>0.05)。8.粪便代谢物检测大鼠粪样代谢组学检测共获得48种代谢物,主要包含氨基酸及其分解物、胺及其化合物、有机酸、核酸、糖、醇类6类代谢物。各组间采用PLS-DA多元统计分析,获得乙酸盐(acetate)、丙酸盐(propionate)、丁酸盐(butyrate)、葡萄糖(glucose)、核糖(ribose)、麦芽糖(maltose)、木糖(xylose)、丙氨酸(alanine)、亮氨酸(leucine)、苯丙氨酸(phenylalanine)、酪氨酸(tyrosine)、缬氨酸(valine)、异亮氨酸(isoleucine)13种差异代谢物。与正常组比较,模型组大鼠粪样代谢物acetate、butyrate、glucose、ribose、alanine、leucine、xylose、phenylalanine、tyrosine、valine、isoleucine浓度明显降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,逍遥散组ribose、alanine、valine、isoleucine浓度明显升高(P<0.05)。结论:1.慢性不可预知温和应激6周,综合动物模型外观表现,大鼠体重、摄食量减少,旷场实验自主行为活动能力下降,糖水偏好率降低,小肠碳末推进率减少,血清D-木糖含量下降,粪便含水量增加,逍遥散方药反证,大鼠不但出现了抑郁、焦虑等肝郁样表现,还出现体重增长缓慢、食欲减少、大便稀软等脾虚样表现,逍遥散具有明显的调节作用。慢性不可预知温和应激6周,可复制肝郁脾虚样动物大鼠模型。2.慢性不可预知温和应激肝郁脾虚大鼠体内存在氨基酸代谢、糖代谢、短链脂肪酸代谢水平下降或紊乱。大鼠粪样中acetate、propionate、butyrate、glucose、ribose、maltose、xylose、alanine、leucine、phenylalanine、tyrosine、valine、isoleucine 13种代谢物,可作为与慢性不可预知温和应激肝郁脾虚关系密切的小分子化合物。3.逍遥散可调节慢性不可预知温和应激肝郁脾虚模型大鼠粪样代谢物ribose、alanine、valine、isoleucine浓度升高。提示逍遥散疏肝解郁抗应激效应可能与调节体内氨基酸和糖代谢具有一定相关性,其具体代谢通路需进一步研究。