论文部分内容阅读
地方流行性牛白血病(Enzootic Bovine leukosis，EBL)是由牛白血病病毒(Bovine leukemia virus，BLV)引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的传染性肿瘤性疾病。该病几乎遍布全世界各养牛国家，在某些牛群中血清阳性率高达60％，是影响世界养牛业发展的重要传染病之一。本研究利用PCR技术，克隆了BLV gp51基因片段，并在大肠杆菌中进行高效表达；以纯化的gp51表达蛋白为包被抗原，建立了牛血清中BLV抗体的ELISA检测方法，为BLV快速诊断试剂的研究奠定了基础。本研究主要进行了如下试验：1．以FLK-BLV病毒株为研究对象，通过培养FLK细胞获得大量BLV；用PCR技术扩增BLV gp51基因，将扩增片段克隆入pCR-Blunt载体并测序，然后用DNASTAR软件对克隆的gp51基因进行了分析；2．将gp51基因亚克隆入pET-32a表达载体，转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析表达状况，并用Western-blot检测蛋白的免疫学反应性；扩大培养后，用不同浓度尿素溶液对包涵体进行洗涤、溶解并透析以纯化、溶解重组表达蛋白BLV-gp51，得到了纯化蛋白；3．以纯化的BLV-gp51蛋白作为抗原包被酶标板，建立血清中牛白血病病毒抗体的间接ELISA检测方法。方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为2.19μg／mL，最佳血清稀释浓度为1：80，二抗最佳工作浓度为1：750；以gp51-ELISA分别检测牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、赤羽病和蓝舌病阳性血清，结果全部为阴性，表明该方法与其它牛类病原抗体无交叉反应。用gp51-ELISA方法对172份被检血清进行了检测，总阳性率达11.63％。结果显示：①通过PCR法成功地扩增了BLV gp51基因，与参考文献中报道的gp51基因和氨基酸序列完全一致；②通过大肠杆菌表达了分子量约为43KD的融合蛋白，Western-blot试验显示表达蛋白BLV-gp51具有结合特异性抗体的活性，并获得了可溶性BLV-gp51；③建立的gp51-ELISA方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点，将为我国地方流行性牛白血病的监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。