背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是全球第二大神经退行性疾病,其典型的临床表现是静止性震颤,肌肉僵直以及姿势与步态异常。其病理特征是黑质致密部多巴胺神经元的选择性死亡^[1]。目前,关于多巴胺神经元死亡的病因尚不清楚,众多因素均被认为参与了帕金森的发病过程。这些因素包括神经炎症^[2],氧化应激^[3],神经毒剂^[4]和蛋白异常聚集^[5]等。在这些因素中,激酶紊乱以及其引起的一系列蛋白异常修饰也受到越来越多的关注^[6]。p38是细胞中一类保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,它参与了炎症,细胞周期调控,细胞分化以及细胞凋亡等细胞生命过程^[7]。p38可以被病原体,炎症,氧化应激等胞外信号激活。生理条件下,激活的p38可以磷酸化相应的下游底物,引起底物功能或含量改变,进而将信号传递至胞核或其他细胞成分,动员细胞进行相应的应答反应。然而,病理条件下p38的紊乱则会破坏细胞稳态,最终引起细胞凋亡。Drosha是一种核糖核酸酶,它的N端有一段丝氨酸精氨酸富集结构域。以往研究提示,该结构域包含p38激酶的磷酸化位点,它决定着Drosha的细胞定位以及蛋白稳定性^[8]。Drosha主要负责把pri-miRNA水解切割成pre-miRNA,在miRNA的生成过程中发挥重要作用^[9]。另外,Drosha被证实具有抵抗氧化应激作用,能够减轻氧化应激对细胞造成的损伤,促进细胞生存。但是,关于Drosha在多巴胺神经元中的表达,调节方式以及生理功能等内容,目前国内外还未见相关的报道。本实验主要研究帕金森病疾病条件下,多巴胺神经元中Drosha的表达变化,调控Drosha水平的相应机制以及Drosha水平对多巴胺神经元存活和帕金森小鼠行为的影响。方法首先,检测帕金森小鼠多巴胺神经元中Drosha蛋白的表达变化。通过立体定向注射技术,在C57小鼠中脑黑质致密部（SNc）注射六羟基多巴按（6-OHDA）构建帕金森小鼠模型。运用免疫荧光染色方法和蛋白免疫印迹技术,确定多巴胺神经元中Drosha的水平。其次,探索多巴胺神经元中Drosha变化的潜在机制。运用蛋白免疫印记技术和免疫荧光技术,检测6-OHDA处理后的SN4741细胞中p-p38,p-Drosha,DGCR8和Drosha水平。通过构建突变型质粒,确定p38的磷酸化位点。最后,探索Drosha对多巴胺神经元生存和帕金森动物行为的影响。过表达野生型和突变型Drosha,通过MTT,TUNEL染色以及蛋白免疫印记技术检测clevated caspase3来观察Drosha含量对SN4741细胞生存的影响。通过蛋白免疫印记技术,免疫荧光技术和DAB染色技术来观察Drosha含量对帕金森小鼠多巴胺神经元生存的影响。通过旷场实验和爬竿实验,观察Drosha含量对帕金森小鼠行为的影响。结果实验一:检验PD小鼠多巴胺神经元Drosha水平变化。建立小鼠帕金森模型后,中脑组织切片免疫荧光结果显示,多巴胺神经元中的Drosha水平明显降低,且多巴胺神经元数量也明显减少。蛋白免疫印记技术结果显示,帕金森小鼠中脑黑质致密部Drosha水平明显降低,而皮质与海马部位的Drosha水平未见明显变化。并且,黑质致密部p38激酶明显激活。实验二:探索多巴胺神经元Drosha水平变化的机制。用6-OHDA短时程处理SN4741细胞构建帕金森细胞模型。蛋白免疫印迹技术结果显示,SN4741细胞中p-p38水平随着处理时间逐渐升高,并在4小时达到高峰。免疫沉淀结果显示,p-Drosha水平随着6-OHDA处理逐渐升高,并在5小时达到高峰,且p38抑制剂SB203580预处理可以逆转p-Drosha水平,证明p38参与了Drosha磷酸化过程。用6-OHDA处理SN4741细胞12小时,蛋白免疫印记结果显示,Drosha水平随毒药浓度增高而降低,提前过表达失活形式p38或者SB203580预处理,均可逆转Drosha水平降低。免疫荧光结果也显示SB203580预处理可以逆转6-OHDA引起的Drosha水平降低,证明p38参与了Drosha降解过程。构建突变型Drosha,证实p38作用于Drosha的磷酸化位点。实验三:验证过表达Drosha对PD小鼠行为缺陷的作用在SN细胞中过表达野生型和突变型Drosha,再用6-OHDA处理细胞。免疫沉淀结果显示,突变型Drosha能够抵抗6-OHDA引起的磷酸化。蛋白免疫印迹结果显示,突变型Drosha可以抵抗6-OHDA引起的降解。MTT,Tunel染色和蛋白印记结果显示,Drosha水平升高促进细胞生存,且mt5 Drosha对细胞的保护效果更佳。通过腺病毒载体在小鼠黑质致密部过表达野生型和突变型Drosha,再构建小鼠帕金森模型。DAB结果和免疫荧光结果显示,Drosha水平升高可以保护纹状体多巴胺神经元末梢和中脑多巴胺神经元,且mt5 Drosha保护效果更明显。旷场实验和爬竿实验结果显示,Drosha水平升高能改善小鼠行为缺陷,且mt5 Drosha的效果更明显。结论我们的实验证明了,在神经毒素6-OHDA诱导的帕金森小鼠模型和SN4741细胞模型中,Drosha的蛋白水平均发生降低。并且,p38的活化及对Drosha的异常磷酸化修饰,是Drosha蛋白水平降低的机制之一。另外,我们证实Drosha的蛋白水平降低是诱发多巴胺神经元死亡的因素之一,而通过过表达手段来维持Drosha蛋白水平,可以减轻6-OHDA对多巴胺神经元的毒性,改善帕金森小鼠的行为缺陷。该实验为解释帕金森发病机制提供了新视角,为帕金森临床治疗提供了新的研究靶点。（1）帕金森细胞与小鼠模型中,Drosha水平降低。（2）Drosha被p38磷酸化修饰并降解,是多巴胺神经元死亡的病理因素之一。（3）过表达Drosha能减轻6-OHDA毒性,促进多巴胺神经元生存,改善帕金森小鼠缺陷行为。