高效液相色谱荧光法测定多胺含量及鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性的研究

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多胺是从微生物到高等生物所有生物体内广泛存在的小分子碱性脂肪族化合物,代表性的物质有腐胺(PUT)、精脒(SPD)、精胺(SPM)。多胺在生物体内起着重要的作用,直接参与生物体内的多种生理活动,如核酸的复制、转录和翻译、蛋白质的合成以及稳定膜的结构,是生物体生长和细胞代谢所必需的痕量活性物质,生物体内多胺的含量与组织的病变、生长发育的水平有直接的关系。因此开发选择性好、灵敏度高、经济实用的分析多胺的方法一直是人们关注和研究的热点之一。而鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成的限速酶,它催化多胺生成的第一步反应,即鸟氨酸脱羧生成腐胺(PUT)。ODC的活性常作为再生组织和肿瘤发生的指标,其活性的测定对研究细胞增殖及癌症的发病机理具有重要意义。 本文改进了丹磺酰氯柱前衍生HPLC法测定生物样品中多胺的方法,以1,7庚二胺为内标,丹磺酰氯作荧光衍生剂,衍生产物经甲苯萃取后进行HPLC分析。采用TSKgelODS-80TMC18(150×4.6mm,5μm)色谱柱,甲醇和水为流动相,程序梯度洗脱(甲醇:水=80:20保持3min,从4min到14min,甲醇比率由80%梯度增至100%),激发波长λEx=340nm,发射波长λEM=515nm,柱温50℃,流速0.8ml·min-1。本法腐胺、精脒和精胺标准曲线的相关系数分别为0.9982、0.9983、0.9979,RSD分别为0.16%、0.19%、0.22%,最低检测限分别为0.17pmol、0.23pmol、0.19pmol。利用本法成功测定了2种发酵食品和癌症患者血液及组织中的多胺含量,均取得了较为满意的结果。 本文还利用改进后的HPLC分析方法,评价了鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性。比较了前列腺肿瘤患者和正常人血液中ODC的活性。结果表明,前列腺肿瘤患者血液和组织中ODC活性约为正常人血液和组织中ODC活性的2~3倍。另外,本实验对肿瘤患者血液中ODC反应的动力学行为进行了研究,表明实验条件下,ODC酶促反应符合一般酶促反应动力学规律,同时测定了实验条件下的Km=87.0481/μmol·L-1,Vmax=3.4532pmol·min-1·L-1。
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