农药是农业生产中必不可少的生产资料,在防治病、虫、草害,以及确保农副产品的保产增收方面发挥着重要的作用。然而在集约化的农业生产过程中,人们长期、大量或不规范地使用农药,造成了农药在环境中的残留富集。阿特拉津是一种在全世界范围内广泛使用的除草剂,虽然已经被欧盟禁用,但许多发展中国家仍在使用。由于阿特拉津的迁移扩散作用,除了对水体、土壤和大气造成污染外,还会随食物链的富集作用威胁到人类的健康。残留在环境中的除草剂被作物过量吸收后,会导致植物体的代谢紊乱并造成伤害。因此,研究植物对阿特拉津的代谢机制及解毒酶的作用显得尤为重要。本论文研究了紫花苜蓿对阿特拉津的毒性反应和积累传导,利用液质联用技术检测阿特拉津在紫花苜蓿体内的降解产物。采用高通量测序的方法研究了阿特拉津在紫花苜蓿中的分子调控解毒机制。糖基转移酶是植物重要的解毒酶之一,利用分子克隆技术获得糖基转移酶基因过表达水稻和拟南芥株系,研究了该基因缓解阿特拉津对植物毒性的作用,以及加速植物体中阿特拉津降解的功能。对紫花苜蓿和水稻中阿特拉津的降解产物进行了汇总分析,研究了硫醇化合物对阿特拉津的降解作用,结合转录组数据和质谱分析结果,阐明了与硫醇化合物代谢相关的基因在阿特拉津胁迫下的表达变化,和小分子硫醇化合物在水稻和紫花苜蓿的解毒途径中起到的不同作用。具体内容以下:1.为了研究阿特拉津残留对紫花苜蓿的伤害,本文选用一系列浓度的阿特拉津(0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10mg/L)处理紫花苜蓿幼苗,结果发现阿特拉津抑制了紫花苜蓿的伸长量、干重和叶绿素含量,影响了紫花苜蓿的正常生长。紫花苜蓿体内的丙二醛含量随着阿特拉津的处理浓度的增大呈现先上升后下降的趋势,并在0.08 mg/L的处理浓度下达到最高值,即对紫花苜蓿的膜脂损伤程度最大。采用丙酮-水超声提取,固相萃取(SPE)小柱净化的前处理方法检测了阿特拉津在紫花苜蓿体内的积累量,结果发现随着阿特拉津处理浓度的加大和处理时间的加长,阿特拉津在紫花苜蓿体内的积累量逐渐增多。生物富集因子(BCF)和传导因子(TF)的数据分析表明,紫花苜蓿对阿特拉津有较强的积累和传导作用(TF>1)。采用UPLC-LTQ-OrbitrapXL-MS/MS分析检测技术,鉴定了阿特拉津在紫花苜蓿体内的降解产物,总共发现了 10个降解产物和9个结合产物。结果表明植物吸收的阿特拉津可以通过化学修饰生成相应的代谢物,如脱异丙基阿特拉津(DIA)、脱氢阿特拉津(DHA)或甲基化阿特拉津(MEA)等。阿特拉津和部分衍生物利用自身不同的官能团与糖、谷胱甘肽和氦基酸发生结合反应,生成结合物如HIA+Glc-H20、HEA+Glc-H2O、ATZ-HCl+Cys、ATZ-HCl+hGSH、DHA+hGSH 和 MEA-HCl+hGSH等。其中,HIA+Glc-H2O、HEA+Glc-H2O、ATZ-HCl+Cys、DHA+Cys、MEA-HCl+hGSH和MEA-HCl+Cys,这些结合物都是首次在植物体内发现。这些结果表明,阿特拉津在紫花苜蓿体内可以通过不同的解毒途径得到降解。在阿特拉津处理下,紫花苜蓿体内的糖基转移酶和谷胱甘肽S-转移酶活性增强,它们可能对阿特拉津的解毒反应起到重要作用。上述研究结果揭示了阿特拉津在紫花苜蓿体内的富集传导和解毒代谢途径,为进一步研究紫花苜对阿特拉津的毒性反应和解毒代谢机制提供帮助。2.为了研究紫花苜蓿对阿特拉津胁迫响应和解毒代谢的分子机制,采用高通量测序技术(RNA-Seq)对紫花苜蓿的转录组进行了大规模测序。构建了四个文库,分别是Root-ATZ(根的对照组,不加阿特拉津),Shoot-ATZ(地上部分对照组),Root+ATZ(根的处理组,加阿特拉津)和Shoot+ATZ(地上部分处理组),用来研究阿特拉津胁迫下紫花苜蓿不同组织的转录组的变化情况。一共获得了 70370个转录本,通过各文库之间的比对发现了大量的差异表达基因(DEGs),用聚类分析对所有的DEGs的表达模式进行了分类。进一步对DEGs进行Gene Ontology(GO)注释分析和Pathway富集分析,发现在阿特拉津的诱导下,许多差异表达基因的生物学功能与胁迫应答、外源物降解和代谢反应有关。此外,初级代谢物和次生代谢物的合成途径上的基因表达发生了变化。分析了与阿特拉津解毒(如GSTs、GTs和ABC转运蛋白)和胁迫响应(如氧化还原反应、结合反应和水解反应)有关的差异表达基因,发现紫花苜蓿体内的相关基因受到显著诱导。为了验证测序结果的准确性,选择8条与解毒代谢外源性物质相关的酶(细胞色素P450、糖基转移酶和谷胱甘肽转移酶)的编码基因进行了实时定量PCR和半定量PCR的验证实验,所选基因在阿特拉津诱导下的表达模式与RNA-Seq测序结果相符,说明测序结果真实可信。上述研究结果为植物中外源性物质诱导的抗逆和解毒基因的研究提供了参考价值。3.植物进化出复杂的解毒途径去应对环境中阿特拉津的胁迫,其中,糖基转移酶是催化结合反应的重要解毒酶之一。水稻是我国重要的粮食作物,目前人们已经完成了水稻的全基因组测序,因此选择对阿特拉津响应的水稻糖基转移酶基因(OsARGT1)为研究对象。首先,获得了水稻和拟南芥的OsARGT1纯合过表达株系各三个。用0.2、0.4和0.8mg/L的阿特拉津处理水稻幼苗6d后,发现过表达水稻的伸长量、干重、叶绿素含量与野生型相比有明显的提高,膜的损伤减小。更重要的是,OsARGT1促进了过表达水稻体内阿特拉津的降解。同时发现,过表达植株的水培营养液中阿特拉津的移除量也比野生型的多。为了进一步探索OsARGT1对环境中阿特拉津是否有促进降解的作用,我们选取阿特拉津在环境中的近似污染浓度(0.01 mg/L)处理野生型和过表达水稻,分时期检测水稻体内的阿特拉津积累量。发现在暴露30和60d后,过表达植株的老叶、成熟叶、新叶和根中的阿特拉津含量均低于野生型的;在暴露100d后,过表达植株的旗叶中阿特拉津含量比野生型减少了 18.92～24.11%;在暴露120 d后,过表达植株的籽粒中阿特拉津含量比野生型低,其中,OsOX-1株系的阿特拉津积累量比野生型减少了 39.84%。为了进一步探索OsARGT1对阿特拉津的解毒机制,利用UPLC串联AB SCIEXTriple TOF 5600质谱检测了过表达水稻株系OsOX-1和野生型水稻体内的阿特拉津代谢情况。共检测到阿特拉津8个代谢物和10个结合物,其中,葡萄糖和羟甲基谷胱甘肽的结合物DIHA+Glc-H2O、HA+Glc-H20和ATZ-HCl+hmGSH首次在植物体内发现。OsOX-1地上部分的5个代谢物和7个结合物含量与野生型相比明显增多,根中有2个代谢物和4个结合物的含量比野生型的高。OsARGT1对拟南芥而言是一个外源基因,将该基因转入拟南芥体内进一步验证其功能的作用。实验结果表明,在阿特拉津胁迫下,过表达拟南芥的干重和叶绿素含量明显比野生型的高,膜损伤减小。此外,过表达拟南芥体内的阿特拉津含量明显低于野生型,且过表达株系的营养液中阿特拉津的移除量比野生型的高,说明OsARGT1促进拟南芥对阿特拉津的降解。4.通过对上述研究结果的总结,发现阿特拉津与含巯基的硫醇化合物的结合反应是其在植物体内的另一主要代谢途径,因此,本文结合转录组和液质数据分析了植物体内硫醇化合物在阿特拉津胁迫响应和解毒过程中起到的作用。首先,采用组织染色法检测紫花苜蓿叶片中活性氧H2O2的含量,发现阿特拉津诱导H2O2的产生,对紫花苜蓿产生氧化胁迫。硫醇化合物具有很多生物角色,包括防御活性氧和自由基、维持细胞氧化还原状态和防御活性亲电性试剂等。分析了与硫醇化合物氧化还原相关的酶(Grx、GPX、GL和GHL等)的编码基因在阿特拉津胁迫下表达变化情况,结果发现很多相关编码基因发生差异表达,如有5个编码Grx的基因在阿特拉津的诱导下显著上调表达,2个编码GPX的基因在地上部分显著上调表达,1个GSNOR编码基因显著下调表达。同时,通过分析谷胱甘肽代谢途径上的合成和分解酶的差异表达情况,发现大部分谷胱甘肽合成酶(yECS、hGSHS和GSHS)上调表达,分解酶GGT下调表达,分解酶APN在地上部分上调表达,在根部下调表达。谷胱甘肽代谢途径中涉及到植物体内重要的硫醇化合物,它们与阿特拉津生成了 S-结合物,其中质谱检测出的响应值最高的是半胱氨酸结合物ATZ-HCl+Cys,因此对紫花苜蓿体内半胱氨酸合成途径上相关酶的基因在阿特拉津胁迫下的表达变化又进行了分析。阿特拉津具有亲电性,可能导致体内细胞的损伤。含有巯基的硫醇化合物可以阻碍有害的亲电试剂的活动,对防御外源性物质有重要作用。其次我们又总结了紫花苜蓿和水稻中阿特拉津与硫醇化合物的结合产物,绘制了代谢途径,经比较两种植物中各个结合物的相对含量发现半胱氦酸S-结合物是两种植物的最主要代谢产物,不同的是hGSH结合物只在紫花茵蓿中检测到,而hmGSH的结合物只在水稻中检测到。同时,在两种植物体内,其他阿特拉津S-结合物的相对含量也有很大差别,表明硫醇化合物对植物体内农药的解毒过程因物种不同而有明显差异。