第一章ADMA代谢酶基因多态性与中国汉族人群冠心病易感性的关联研究研究背景冠心病(Coronary heart disease, CHID)是最主要的心血管疾病,也是造成死亡的主要疾病之一。冠心病的风险因素包括遗传因素和环境因素两个方面。动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠心病发生的最根本病理改变。非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)一种内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)抑制剂,通过抑制NO的合成,导致内皮功能紊乱。同时,ADMA通过抑制NO的生物合成和促进炎症过程,在动脉硬化的发生发展中起重要作用。人体内大部分ADMA经ADMA代谢酶代谢灭活,ADMA代谢酶主要包括二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase1, DDAH1)和丙氨酸乙醛酸转氨酶2(Alanine-glyoxylate aminotransferase2, AGXT2)代谢灭活。研究表明,ADMA灭活酶基因多态性与心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)易感性和血浆中ADMA水平均相关,本研究的目的旨在阐明DDAH1和AGXT2基因多态性是否与中国汉族人冠心病易感性相关,同时探究这两个基因多态对血浆中ADMA的影响,为CHD寻找新的易感位点和新的防治策略。方法1.病例对照研究DDAH1和AGXT2基因多态性与CHD易感性的关系收集1103例正常对照和942例CHD患者血液标本,提取基因组DNA。利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的分析方法,对正常对照组和CHD样本进行AGXT2rs37369和1DDAH1rs233113位点基因分型。应用卡方检验和Logistic回归分析基因型与CHD发病风险的关系。2. DDAH1和AGXT2基因多态性对健康志愿者血浆中ADMA水平影响利用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法测定311例健康志愿者血浆中ADMA浓度。单因素方差分析(One-way ANOVA)和独立样本t检验分析DDAH1和AGXT2基因型与血浆中ADMA水平间关系。结果1.Logistic回归分析对CHD潜在混杂因素进行校正后发现,DDAH1rs233113AT基因型和T等位(AT+TT)可以显著降低总人群中CHD的发病风险(OR=0.79,95%CI:0.65-0.95, P=0.013和OR=0.82,95%CI:0.69-0.98, P=0.028);在非吸烟人群中,rs233113AT基因型(OR=0.73,95%CI-0.58-0.92,P=0.009)和T等位(OR=0.78,95%CI:0.63-0.98,P=0.030)可以显著降低CHD的发病风险；对糖尿病进行分层分析发现,AT基因型(OR=0.77,95%CI:0.63-0.94,P=0.011)和T等位(OR=0.79,95%CI:0.65-0.96,P=0.015)可降低无糖尿病个体CHD的发病风险；同时AT基因型(OR=0.73,95%CI:0.56-0.93, P=0.013)和T等位(OR=0.76,95%CI：0.60-0.96,P=0.023)可以显著降低不吸烟人群中无糖尿病个体CHD发病风险。2.CHD患者中AGXT2rs37369GG基因型的频率显著高于对照组(18.5%vs14.8%, P=0.025);与rs37369A (AA+AG)基因型相比,rs37369GG基因型可显著升高吸烟人群中CHD的发病风险(OR=2.21,95%CI:1.24-3.92, P=0.007),以及显著升高吸烟且同时患有糖尿病个体的CHD发病风险(OR=3.32,95%CI：1.14-9.67,P=0.028)。3.在吸烟个体中,DDAH1rs233113AT基因型个体血浆中ADMA水平显著高于其它两种基因型(P=0.038和P=0.036)；在不吸烟人群中,AGXT2rs37369GG基因型个体血浆中ADMA水平显著低于A等位(AA+AG)携带者(0.45±0.05μM, n=43vs0.65±0.04μM,n=184,P=0.003),但是在吸烟人群中rs37369GG基因型个体血浆中ADMA水平显著高于rs37369A等位基因携带者(0.92±0.16μM, n=14vs0.51±0.05μM, n=70,P=0.004),吸烟人群中AGXT2rs37369GG基因型个体血浆ADMA水平也是显著高于不吸烟人群rs37369GG基因型个体(P=-0.012)。4.携带DDAHl rs233113和AGXT2rs37369两个SNP位点任一风险基因型均可显著升高冠心病的发病风险,且健康对照吸烟个体中同时携带两个SNP位点风险基因型的血浆中ADMA水平显著升高(P=0.003)。结论1. DDAHl rs233113多态可降低中国汉族人群冠心病的发病风险,尤其可以降低不吸烟和不伴糖尿病的个体冠心病的发病风险。2.AGXT2rs37369多态可显著升高中国汉族吸烟人群冠心病的发病风险,尤其可升高吸烟且同时伴有糖尿病的个体冠心病的发病风险,其机制可能与吸烟状态下血浆中ADMA水平升高有关。3. DDAH1rs233113和AGXT2rs37369多态性之间存在联合作用,共同影响中国汉族人群冠心病的发病风险。第二章ADMA代谢酶基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中易感性和预后的关联研究研究背景脑卒中(Stroke)是全世界范围内最主要的致残原因,在所有死因中位居第二,缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)是最常见的脑卒中类型,占全部脑卒中的60%-80%。我国人群脑卒中发病率和患病率总体呈上升趋势,并且其致残率和致死率较高,是严重危害我国老年人健康与生命的主要疾病。IS病因也包括环境因素和遗传因素。颈动脉粥样硬化是IS最重要的病因和危险因素,它与梗塞的发生、发展、复发以及梗死的部位密切相关。非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)通过抑制一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)活性抑制NO的合成,从而导致内皮功能紊乱。ADMA造成的内皮功能紊乱是动脉硬化发生的起始步骤。人体内绝大部分ADMA由二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase1, DDAH1)和丙氨酸乙醛酸转氨酶2(Alanine-glyoxylate aminotransferase2, AGXT2)代谢灭活,研究表明ADMA代谢酶基因多态性与循环中ADMA水平相关。本研目的旨在探讨AGXT2和DDAH1基因的遗传多态性是否与IS易感性和预后相关,为IS寻找新的易感位点和新的防治策略。方法1.病例对照研究AGXT2和DDAHl基因多态性与IS易感性的关系收集1103例正常对照和1012例IS患者血液标本,提取基因组DNA。利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对正常对照组和IS样本进行AGXT2rs37369、DDAH1rs233113和rs233112位点的基因分型。应用卡方检验和Logistic回归分析基因型与IS发病风险的关系。2.AGXT2和DDAH1基因多态性与IS预后关系对部分IS患者进行电话随访,详细记录患者是否有事件发生(包括是否死亡、是否复发脑梗塞和心梗梗塞),事件发生时间等信息,应用卡方检验和Kaplan-Meier分析AGXT2和DDAH1基因多态性对IS患者预后的影响。结果1.AGXT2rs37369GG基因型和A等位(AA+AG)分布在病例组和对种组分布无显著差异(P=0.163),同时与IS易感性也不相关,。2.DDAH1rs233113与总人群、吸烟人群和不吸烟人群中IS易感性不相关。以高血压和糖尿病分层分析发现,与rs233113AA基因型相比,AT基因型可以显著降低糖尿病患者IS发病风险(OR=0.73,95%CI=0.53-0.99, P=0.046)。3.对照组中DDAH1rs233112G等位基因(AG+GG)频率显著高于病例组(71.6%vs66.7%, P=0.020)。Logistic回归分析发现,与rs233112AA基因型个体相比,总人群中AG基因型和GG基因型个体以及G等位(AG+GG)携带者IS的发病风险均显著降低(OR=0.78,95%CI=0.63-0.96,P=0.019; OR=0.76,95%CI=0.58-0.99,P=0.045和OR＝0.77,95%CI=0.63-0.94,P=0.011);rs233112AG基因型、GG基因型和G等位携带(AG+GG)还可显著降低高血压个体IS的发病风险(OR=0.73,95%CI=0.57-0.92, P=0.007；OR=0.71,95％CI=O.52-0.96,P=0.026和OR=0.72,95%CI=0.58-0.90,P=0.003)；同时rs233112AG基因型和G等位(AG+GG)可以显著降低糖尿病患者IS的发病风险(OR=0.59,95%CI=0.42-0.84,P=0.003和OR=0.65,95%CI=0.47-0.90.P=0.010)。4.与同时携带DDAH1rs233113和rs233112保护基因型个体比,同时携带两个位点风险基因型(rs233113AA,rs233112AA)个体IS风险显著升高(OR=1.30,95%CI=1.05-1.62,P=0.017),且IS患者风险单倍型(rs233113A/rs233112A)的频率显著高于rs233113A/rs233112G和rs23113T/rs233112A单倍型(P=0.017和P=0.026)。5.AGXT2rs37369、DDAH1rs233113和rs233112与IS预后不相关,但是在发现人群和合并人群中有事件发生的IS患者中rs233113T等位(AT+TT)频率有升高趋势(P=0.087和P=0.097)。结论1.DDAH1rs233113和rs233112可以降低IS的发病风险,尤其可以降低伴有糖尿和高血压的个体IS的发病风险。2. DDAH1rs233113和rs233112可以通过联合作用升高IS的发病风险。3. AGXT2rs37369多态与IS易感性不相关。4. AGXT2rs37369、DDAH1rs233113和rs233112与IS的预后无显著相关。第三章miR-455-5p对DDAHl表达调节作用及DDAHl遗传多态性的影响研究背景通过本论文第一、二章的研究,我们发现DDAH1rs233113多态与冠心病(Coronary heart disease, CHD)的易感性相关,同时DDAH1rs233113和rs233112多态还与缺血性脑卒中(Ischemic stroke, IS)易感性相关。本课题组的前期研究发现,rs233113和rs233112多态可显著升高原代培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)内DDAH1的表达,升高细胞裂解液对ADMA的代谢活性,降低细胞内ADMA的浓度,但这两个SNP是否为功能性SNP,以及两个SNP发挥作用的机制仍不清楚。微小RNA (MicroRNA, miRNA)一类内源性的长约22个碱基的非编码RNA,通过与靶基因3’非编码区Jntranslated regions,UTR)以碱基互补配对方式结合调控靶基因的表达。DDAH1的表达受微小RNA (MicroRNA, miRNA)调控。生物信息学分析发现,miR-455-5p在人DDAH13’UTR区有两个的miRNA识别元件(MicroRNA recognition elements, MRE),其中MRE1位于rs233113上游100bp左右处,MRE2位于rs233112处。通过查阅文献,我们发现miR-455-5p是一种与炎症反应密切相关的miRNA,炎症状态下其表达显著升高。因此,基于本学位论文前两章的研究基础和以上背景,我们提出DDAH1rs233112和rs233113多态可能通过影响miR-455-5p与DDAHl的结合,从而影响miR-455-5p对DDAH1的表达调控,最终影响动脉硬化性心脑血管疾病的发生发展。本研究旨在查明miR-455-5p是否对DDAH1产生直接抑制作用,查明rs233112和rs233113多态在miR-455-5p介导DDAH1表达调节中的作用,以明确rs233112和rs233113多态性影响心脑血管疾病发病风险和预后的分子机制,为动脉硬化性心脑血管疾病寻找新的遗传标记物和防治策略。方法1.miR-455-5p模拟物(mimic)转染HUVEC-C观察对miR-455-5p表达、DDAH1mRNA和蛋白表达的影响使用不同浓度miR-455-5p mimic(20.40.80nM)转染HUVEC-C24h,real-time PCR检测niR-455-5p和DDAH1mRNA表达,western-blot检测DDAH1蛋白表达。2.健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中观察miR-455-5p和DDAH1mRNA表达水平间相关性及rs233113和rs233112多态性的影响招募健康志愿者并抽取外周血,分离PBMC,提取PBMC中的DNA和RNA,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对每个个体进行DDAH1rs233113和rs233112基因分型,应用real-time PCR检测miR-455-5p和DDAH1mRNA表达,Pearson相关性分析miR-455-5p与DDAH1mRNA表达水平间的相关性。3.原代HUVEC中观察miR-455-5p与DDAH1mRNA表达、ADMA代谢活性和细胞内外ADMA水平间相关性及rs233113和rs233112多态性的影响分离和培养原代HUVEC, PCR-RFLP对脐静脉组织进行基因分型,第4代内皮细胞于6孔板中培养24小时后,real-time PCR检测DDAH1mRNA表达,western-blot检测DDAH1蛋白表达,ELISA检测细胞内外ADMA浓度以及ADMA代谢活性,Pearson相关性分析进行结果分析。4.肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理HUVEC-C观察miR-455-5P、DDAH1mRNA和蛋白表达变化不同浓度TNF-α(25、50、100ng/ml)处理HUVEC-C24h后,real-time PCR检测miR-455-5p和DDAH1mRNA表达,western-blot检测DDAH1蛋白表达。5. HUVEC-C和HEK293细胞中miR-455-5p与不同报告基因质粒共转染对报告基因活性的影响PCR扩增DDAH1基因3’-UTR区含miR-455-5p两个MRE的序列,连接到双报告基因质粒pmirGLO上,定点突变两个位点分别包含rs233113和rs233112多态位点不同单倍型的质粒(rs233113A-rs233112A、rs233113A-rs233112G、rs233113T-rs233112A和rs233113T-rs233112G),以及两个MRE分别为野生型和突变体的质粒[MRE1-A-A(野生型质粒)、MRE1-A-MRE2mut、MRE1-T-MRE2mut、 MRE1mut-A-A、MRE1mut-A-G、 MRE1mut-A-MRE2mut],将报告基因质粒与不同浓度miR-455-5p mimic (10、20、40nM)或阴性对照(20nM)共同转染HUVEC-C和HEK293细胞24小时后,收集细胞并取裂解液,双荧光素酶报告实验测定荧光素酶活性,查明miR-455-5p模拟物对不同质粒报告基因活性的影响。结果1.HUVEC-C转染miR-455-5p mimic24h呈浓度依赖性地上调细胞内miR-455-5p表达(P<0.05),同时DDAH1三个转录本的mRNA表达及DDAH1蛋白表达显著下降。2.不同浓度TNF-α (25、50、100ng/ml)处理HUVEC24h均可显著上调HUVEC细胞内miR-455-5p表达(P<0.05),100ng/ml TNF-α可显著下调DDAH1三个转录本mRNA表达(P<0.05),50ng/ml和100ng/ml TNF-α处理可显著下调DDAH1蛋白表达,但25ng/mlTNF-α对DDAH1的蛋白表达无显著影响。3.在携带rs233113T等位基因的个体来源的PBMC中,miR-455-5p和DDAH1-V1mRNA表达呈显著负相关(R=-0.636,P=0.026,n=12)；在原代培养的HUVEC中,]miR-455-5p和DDAH1-V1mRNA表达也呈显著的负相关(R=-0.512,P=0.018,n=21),且这种显著的相关性主要出现在携带rs233113T等位和rs233112G等位的个体来源的HUVEC中(rs233113T等位基因携带者：R=-0.764,P=0.017, n=9; rs233112G等位基因携带者：R=-0.660,P=-0.010,n=14)。4.在原代培养的HUVEC中,miR-455-5p表达水平与细胞裂解液ADMA的代谢活性间呈显著的负相关(R=-0.608, P=0.036, n=12),与细胞内ADMA水平呈显著正相关(R=0.628, P=0.029, n=12)。5.在HUVEC-C和HEK293细胞中,10、20、40nM的miR-455-5p mimic均可显著下调rs233113A-rs233112A、rs233113A-rs233112G和rs233113T-rs233112A报告基因质粒活性；但对于rs233113T-rs233112G报告基因质粒,在HUVEC-C中只有20和40nM miR-455-5p mimic处理可显著下调该质粒的报告基因活性,而在HEK293细胞中,只有40nM miR-455-5p mimic才可显著下调该报告基因质粒的报告基因活性。6. HUVEC-C中,10、20、40nM的miR-455-5p mimic均可以显著下调MRE1-A-A(野生型质粒)和MRE1-A-MRE2mut (MRE2识别位点突变质粒)质粒报告基因活性,20和40nM的1niR-455-5pmimic可显著下调MRE1mut-A-A (MRE1识别位点突变质粒)质粒报告基因活性,但是各浓度miR-455-5p mimic均不影响MRE1-T-MRE2mut. MRE1mut-A-G和MRE1mut-A-MRE2mut质粒的报告基因活性。结论1.DDAHl是miR-455-5p的靶基因,同时通过DDAH13’-UTR区的两个MRE发挥抑制DDAH1表达的作用；2.TNF-α可通过上调miR-455-5p的表达,从而下调DDAH1的表达。3. DDAH1rs233113和rs233112多态性分别通过MRE1和MRE2影响miR-455-5p下调DDAH1表达的作用。4. DDAH1rs233113和rs233112构成的单倍型对DDAH1报告基因质粒活性的影响高于单个SNP位点的影响。