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目的:胃癌是常见的恶性肿瘤,发病率在我国居各类肿瘤第二位,转移是导致胃癌患者死亡的主要原因之一。绝大多数实体肿瘤均有不同程度的缺氧,且同一肿瘤组织内不同区域的氧气浓度有所不同,一般维持在2%以下。肿瘤细胞为了适应低氧环境、维持自身生存,更易于向富含氧气和营养的区域转移。现有研究表明,除了以低氧诱导因子HIFs为代表的转录因子通过转录多种基因诱导血管新生、促进肿瘤细胞糖酵解、上皮间质转化(EMT)及细胞外基质(ECM)重建等,进而促进肿瘤细胞发生转移外,乙酰化、甲基化异常引起的表观遗传学改变,糖基化水平改变引起的糖蛋白功能异常等因素均参与了低氧促进的肿瘤转移。然而,目前在肿瘤低氧微环境中,表观调控和翻译后修饰异常促进转移的作用机制尚不十分明确。 为了更真实地模拟肿瘤低氧微环境,我们建立了低氧耐性胃癌细胞系,并发现在低氧耐性胃癌细胞中,与c-MET蛋白水平轻度上调相比,其磷酸化水平明显升高。研究表明,低氧促进的HIF-1α稳定表达可通过上调c-MET促进肿瘤细胞转移。然而,长期缺氧可抑制HIF-1依赖性的基因转录。我们的低氧耐性胃癌细胞中,c-MET磷酸化水平仍明显升高。因此,我们建立的低氧耐性胃癌细胞中促进c-MET活化的机制尚不清楚。另有研究表明,c-MET蛋白前体经过糖基化修饰后形成包含α和β亚基的成熟、具有活性的c-MET蛋白,提示c-MET的翻译后修饰也可影响其活性及功能。然而,低氧耐性胃癌细胞中c-MET活化是否也有翻译后修饰参与尚不得而知。 我们通过对亲本胃癌细胞与低氧耐性胃癌细胞进行表达谱芯片检测,发现与翻译后修饰密切相关的分子——SIRT5表达明显上调。SIRT5是一类NAD+依赖的、高度保守的去乙酰化酶家族成员之一。SIRT5虽然作为去乙酰化酶被发现,但其去琥珀酰化酶活性明显高于其去乙酰化酶活性。研究表明,SIRT5可通过介导脂肪酸β-氧化关键酶、酮体生成关键酶的去琥珀酰化修饰影响其活性,参与细胞能量代谢的多个环节。然而,SIRT5在肿瘤中作用的相关研究较少,SIRT5可调节哪些底物蛋白的去琥珀酰化水平影响肿瘤细胞的生物学功能及作用机制尚不十分清楚。现有研究发现SIRT5可调节丙酮酸激酶M2(PKM2)的去琥珀酰化增强肿瘤细胞的抗氧化能力并促进细胞增殖。但是,SIRT5是否影响肿瘤转移,是否能影响c-MET的磷酸化活性尚无报道。 在本研究中,我们利用低氧耐性胃癌细胞,从琥珀酰化修饰的角度探讨SIRT5在促进胃癌转移中的作用,及其对c-MET磷酸化活化的影响。对寻找胃癌转移治疗的新靶点,提高胃癌治疗效果具有重要意义。 方法:1.倒置显微镜观察亲本胃癌细胞和低氧耐性胃癌细胞的形态变化。2.transwell检测胃癌细胞迁移能力。3.蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测亲本和低氧耐性胃癌细胞蛋白的表达水平。4.蛋白芯片检测亲本细胞和低氧耐性胃癌细胞中HGF表达水平。5.siRNA转染,瞬时沉默低氧耐性胃癌细胞中SIRT5基因。6.统计学处理:所有数据均为3次独立实验结果,以均值±标准差((x)±s)表示。采用SPSS17.0统计软件进行t检验,P<0.05有统计学意义。 结果:1.低氧耐性胃癌MGC803/hypo和BGC823/hypo细胞迁移能力增强。在长期2%O2条件下培养胃癌细胞MGC803和BGC823,建立低氧耐性胃癌细胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo。与亲本胃癌细胞成多角形且排列紧密相比,低氧耐性胃癌细胞变成长梭形、结构松散;且转移能力增强。2.低氧耐性胃癌细胞中c-MET磷酸化过度活化。与亲本胃癌细胞相比,低氧耐性胃癌细胞中c-MET水平仅有轻度上调或无变化,p-MET水平明显上调。3.c-MET活化促进低氧耐性胃癌细胞迁移。抑制低氧耐性胃癌细胞中c-MET活化后,c-MET下游信号分子ERK、STAT3活化被抑制,且细胞迁移能力下降。4.低氧条件下,HGF、EGFR并非c-MET活化主导因素。与亲本MGC803细胞相比,低氧耐性MGC803/hypo细胞中HGF表达水平无明显变化,且抑制低氧耐性胃癌细胞中EGFR表达后,c-MET无明显活化。5.低氧条件下,SIRT5表达水平明显升高,且促进胃癌细胞迁移。与亲本胃癌细胞相比,低氧耐性胃癌细胞中SIRT5表达水平明显升高,且瞬时沉默SIRT5后,低氧耐性胃癌细胞迁移能力明显下降。6.SIRT5介导琥珀酰化水平降低。与亲本胃癌细胞相比,低氧耐性胃癌细胞琥珀酰化水平明显降低,乙酰化水平无明显变化。瞬时沉默SIRT5后,细胞琥珀酰化水平明显升高,乙酰化水平无明显变化。7.SIRT5通过提高c-MET磷酸化水平促进低氧耐性胃癌细胞迁移。c-MET活化关键位点Tyr1234和Tyr1235附近具有琥珀酰化基序特征,且瞬时沉默低氧耐性胃癌细胞中SIRT5后c-MET磷酸化水平几乎完全被抑制,且迁移能力明显下降。 结论:1.低氧诱导的c-MET通过激活ERK和STAT3通路促进胃癌细胞迁移。2.低氧诱导的SIRT5通过介导去琥珀酰化提高c-MET磷酸化水平,促进胃癌细胞的迁移。