研究目的：骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤,侵袭性高且血行转移早。近年来随着手术以及放化疗水平的提高,骨肉瘤患者的5年生存率有所提升,但是总体治愈率仍未出现显著突破。由于缺氧而引发的肺转移是造成骨肉瘤患者死亡的一个重要原因。因此,深入研究缺氧促进骨肉瘤转移的分子机制,并从中发现可干预的靶点,有望为临床骨肉瘤的治疗提供指导并推动新型靶向抗肿瘤转移药物的研发。研究方法：第一部分：缺氧微环境对WSB1蛋白表达的调控作用以及WSBl与骨肉瘤恶性转移的相关性研究本研究采用人源性骨肉瘤细胞系(KHOS/NP、U2OS以及MG63)、原代骨肉瘤细胞株(MDOS15、MDOS20)作为研究对象。(1)免疫组化分析HIF-1α与WSB1表达的相关性;(2)免疫荧光考察HIF-1α与WSB1蛋白的共定位情况;(3)Western blotting检测WSB1蛋白水平在缺氧诱导以及过表达HIF-1α后的变化;(4)荧光定量PCR技术检测WSB1 mRNA水平在缺氧诱导以及过表达HIF-1α后的变化;(5)双荧光素酶报告基因检测结合染色质免疫共沉淀实验研究HIF-1α对WSB1的调控机制及两者的结合区域;(6)Transwell实验检测骨肉瘤原代细胞株在缺氧环境中迁移能力的变化；(7)采用分子克隆手段构建野生型WSB1质粒,制备野生型WSB1以及可敲低WSB1的慢病毒;(8)Transwell结合划痕修复实验观察骨肉瘤细胞分别在过表达野生型WSB1以及敲低WSB1后迁移能力的变化;(9)建立过表达野生型WSB1及敲低WSB1的KHOS/NP细胞的裸小鼠肺转移模型,通过活体成像技术结合H&E染色检测骨肉瘤细胞在裸小鼠体内的肺转移情况。第二部分：WSB1促进骨肉瘤转移的分子机制研究(1)采用分子克隆手段构建SOCS box结构域缺失或突变的WSB1质粒,并制备SOCS box结构域缺失或突变的WSB1慢病毒;(2)Transwell实验观察骨肉瘤细胞分别在过表达野生型WSB1、SOCS box结构域缺失或突变情况下迁移能力的变化;(3)应用SILAC定量蛋白质组学分析,寻找在WSB1调控骨肉瘤转移过程中发挥关键作用的蛋白;(4)免疫组化染色分析WSB1与转移相关蛋白RhoGDI2表达的相关性;(5)免疫沉淀结合免疫荧光证明WSB1与RhoGDI2的结合;(6)免疫荧光检测WSB1对于骨肉瘤细胞膜表面伪足形成能力的影响;(7)Time-lapse呈像研究WSB1对于骨肉瘤细胞运动能力的调控作用;(8)建立过表达WSB1、同时过表达WSB1及RhoGDI2、过表达RhoGDI2的KHOS/NP细胞的裸小鼠肺转移模型,通过荧光显微镜观察结合H&E染色检测骨肉瘤细胞的体内肺转移情况。研究结果：第一部分：缺氧微环境对WSB1蛋白表达的调控作用以及WSB1与骨肉瘤恶性转移的相关性研究(1) 骨肉瘤细胞中WSB1蛋白与HIF-1α蛋白表达呈高度相关采用免疫组化法检测40例骨肉瘤患者组织切片中WSB1与HIF-1α蛋白的表达情况并作病理学评分统计,计算得出两者的相关系数R值为0.825,呈现显著的正相关性;免疫荧光实验验证裸小鼠荷骨肉瘤移植瘤组织切片中WSB1与HIF-1α的表达呈现良好的共定位状态。以上结果表明,WSB1可能是HIF-1α的靶基因。将骨肉瘤细胞系KHOS/NP、U2OS、MG63及原代骨肉瘤细胞MDOS15、MDOS20分别置于常氧及缺氧环境中培养24小时,Western blotting检测发现WSB 1蛋白表达在缺氧环境中显著增加。在DMOG, DFX两种缺氧造模药物的作用下,KHOS/NP细胞中WSB1蛋白表达水平也呈现浓度依赖性增加。采用质粒转染法在KHOS/NP细胞中过表达HIF-1α蛋白,Western blotting结果显示WSB1蛋白高度依赖于HIF-1α蛋白的表达,而通过小分子RNA干扰技术沉默HIF-1α后,缺氧诱导的WSB1表达增加被显著逆转。以上结果表明,缺氧环境中HIF-1α蛋白介导了WSB1蛋白表达的增加。(2)缺氧条件下HIF-1α蛋白可转录激活WSB1并诱导其蛋白表达增加如前所述,缺氧诱导可上调骨肉瘤细胞中WSB1蛋白表达,且WSB1蛋白与HIF-1α表达具有正相关性并呈现共定位状态,提示经典的缺氧转录因子HIF-1α可能在这一现象中有重要的作用。鉴于转录因子通常可在转录层面调控下游基因的表达,我们首先采用RT-PCR法检测缺氧环境中及过表达HIF-1α后KHOS/NP细胞内WSB1的mRNA水平,结果显示缺氧环境及过表达HIF-1α均可显著上调WSB1的tnRNA水平。然后,我们通过分子克隆技术构建包括WSB1启动子区域以及三个HRE结合区域(-1768位点,-1461位点,-339位点)分别突变的质粒并与HIF-1α质粒共同转染至细胞中,双荧光素酶报告基因检测结果表明HIF-1α可明显转录激活WSB1基因,且HIF-1α可能是通过结合在WSB1启动子区域的-339位点实现对其的转录调控,并在染色质免疫共沉淀实验中得到了进一步确证。以上结果表明HIF-1α可转录激活WSB1基因并诱导其蛋白表达增加。(3) WSB1蛋白的表达水平与临床骨肉瘤患者的转移率呈正相关性通过对临床骨肉瘤患者的癌组织及癌旁组织样本进行免疫组化分析发现,WSB1在癌组织区域的阳性表达率高达88%,且多呈强阳性;而在癌旁组织区域中,WSB1的阳性表达率仅为32%。这一结果提示WSB1可作为骨肉瘤诊断的生物学标记物,并且可能调控骨肉瘤的恶性进展。通过回顾性调研28位骨肉瘤患者的3年临床随访纪录,发现WSB1的表达水平与骨肉瘤患者的转移率呈现正相关性。 以上结果表明WSB1的表达水平与临床骨肉瘤患者的转移密切相关,提示WSB1可能参与介导了缺氧促进的骨肉瘤转移。(4)WSB1蛋白可促进骨肉瘤细胞的体外迁移能力制备野生型WSB1以及可敲低WSB1蛋白表达的慢病毒颗粒并感染骨肉瘤细胞株KHOS/NP以及U2OS,在Transwell以及划痕修复实验中发现过表达WSB1蛋白能够显著增加两株骨肉瘤细胞的运动迁移能力;而敲低WSB1则能够逆转缺氧促进的骨肉瘤细胞体外迁移能力。以上结果提示WSB1蛋白可促进骨肉瘤细胞的体外迁移能力。(5)WSB1蛋白可促进骨肉瘤细胞的体内肺转移能力构建过表达野生型WSB1及敲低WSB1的KHOS/NP细胞株并建立相应的裸小鼠肿瘤肺转移模型,micro-PET活体成像结果显示,过表达野生型WSB1能够显著增加骨肉瘤细胞在裸小鼠体内的肺部转移能力,对肺组织切片进行H&E染色统计转移灶点数也证实以上结果;而敲低WSB1则能够明显抑制骨肉瘤细胞的肺部转移。以上结果提示WSB1蛋白可促进骨肉瘤细胞的肺转移能力。第二部分：WSB1蛋白促进骨肉瘤转移的分子机制研究(1)WSB1蛋白促进肿瘤转移的作用依赖于其自身E3酶活性WSB1蛋白主要由N端的七个WD40重复结构域和C端的SOCS box结构域构成。已有研究表明,SOCS box结构域能够与延伸蛋白(Elongin) B和C相互结合,形成E3泛素连接酶复合物,是WSB1发挥E3酶活性的关键区域。我们构建了WSBl SOCS box结构域缺失或突变的质粒,并与野生型WSB1进行比较,发现SOCS box结构域的缺失或突变均能够明显逆转WSB1促进骨肉瘤转移的生物学作用。这一结果表明WSB1蛋白促进肿瘤转移的生物学功能依赖于其自身E3泛素连接酶活性。(2) SILAC定量蛋白质组学分析WSB1通过其E3酶活性调控肿瘤转移的下游底物蛋白我们对WSB1过表达及空白载体组的KHOS/NP细胞进行SILAC定量蛋白质组学分析,质谱鉴定得到1078个变化三倍以上的差异蛋白。前期结果表明WSB1促进骨肉瘤转移的生物学效应依赖其E3泛素连接酶活性,我们推测WSB1可能通过降解某个转移相关蛋白而发挥这一功能。基于此,我们对518个发生下调的蛋白进行重点考察。差异分析报告显示转移相关蛋白RhoGDI2变化最为显著,提示其可能作为WSB1潜在的底物蛋白介导了WSB1对于骨肉瘤转移的调控过程。(3)WSB1可促进转移相关蛋白RhoGDI2经由泛素蛋白酶体途径发生降解通过免疫组化染色对骨肉瘤患者组织样本中WSB1与RhoGDI2蛋白的表达水平进行考察,分析发现两者的相关系数R值为-0.65,表明两者表达呈现负相关性。通过Westren blotting检测发现,在WSB1过表达的情况下RhoGDI2蛋白水平显著下调。但是,当WSB1的SOCS box结构域缺失后,其下调RhoGDI2的作用即被逆转,提示WSB1可通过其E3泛素连接酶活性负性调控RhoGDI2o在蛋白合成抑制剂CHX的作用下,WSB1能够加速RhoGDI2的降解,表明WSB1下调RhoGDI2可能是通过促进其降解而实现。而在蛋白酶体抑制剂MG132的作用下,WSB1下调RhoGDI2的现象被逆转,提示WSB1降解RhoGDI2的过程可能经由泛素—蛋白酶体通路。免疫荧光实验表明WSB1蛋白与RhoGDI2蛋白呈现较明显的共定位现象,免疫沉淀结果显示WSB1与RhoGDI2蛋白能够直接发生结合,并且WSB1能够促进RhoGDI2的多聚泛素化修饰。以上结果均表明WSB1可促进转移相关蛋白RhoGDI2经由泛素—蛋白酶体途径发生降解。(4)WSB1可激活RhoGDI2下游信号通路我们接着考察了WSB1对RhoGDI2调控的Rho信号通路的影响。通过pull-down实验检测发现,过表达WSB1能够激活RhoGTPases家族蛋白成员Rac1。 Rac1蛋白的主要生物学功能为调控细胞骨架重构从而促进细胞运动。因此,我们通过免疫荧光实验考察KHOS/NP细胞骨架的变化。结果显示,过表达WSB1能够促进肌动蛋白Actin的多聚化并促进细胞膜表面伪足的形成,从而增强细胞的运动迁移能力。以上结果表明,WSB1可通过激活RhoGDI2下游Rho信号通路增加肿瘤细胞的运动潜能。(5)过表达RhoGDI2能逆转WSB1的转移促进功能我们构建了过表达WSB1、过表达RhoGDI2及同时过表达WSB1、与RhoGDI2的KHOS/NP细胞。通过体外Transwell实验检测发现,过表达RhoGDI2能够逆转WSB1促进骨肉瘤细胞迁移的现象。进一步,我们构建上述KHOS/NP细胞的裸小鼠肺转移模型,体式荧光显微镜观察肺部转移灶点结合组织切片的H&E染色的结果表明,过表达RhoGDI2能够显著逆转WSB1促进骨肉瘤细胞体内肺转移的现象。研究结论：缺氧条件下,HIF-1α蛋白可转录激活E3泛素连接酶家族蛋白WSB1并诱导其蛋白表达增加,而缺氧激活的WSB1则通过其E3连接酶活性促进底物蛋白RhoGDI2经由泛素蛋白酶体途径发生降解,进而激活RhoGDI2下游信号通路,促进肌动蛋白Actin多聚化程度的增加和细胞伪足的形成,从而增强肿瘤细胞的运动潜能,最终介导了缺氧促进的骨肉瘤转移过程。我们的研究发现了缺氧促肿瘤转移的全新信号通路HIF-1α-WSB1-RhoGDI2,可能成为继HIF-1α-VEGF以外的另一重要缺氧调控肿瘤恶性演进的信号通路,丰富了缺氧微环境促进肿瘤转移的理论体系。探索基于缺氧调控WSB1等E3连接酶活性以干预肿瘤转移的新领域,并为治疗骨肉瘤缺氧转移提供了新靶点和新思路。