慢性痛是一种十分常见的临床疾病,其中最复杂、最难治的便是由于组织或神经损伤导致的神经病理性痛(neuropathic pain)。由于疼痛症状迁延不愈导致其经常伴有焦虑和抑郁等负性情绪,两者交互恶化给患者造成极大的生理和心理负担。尽管人们对神经病理性痛的研究在外周神经系统和脊髓水平取得了一定的进展,但是对神经病理性痛状态下大脑内痛觉调控的高级中枢尚缺乏足够的认识。近年来岛叶皮层(insular cortex,IC)逐渐受到越来越多地关注,有报道指出损毁双侧IC可以显著缓解大鼠炎性痛和神经病理性痛样行为,同时因胶质瘤或脑梗累及IC的患者手术切除此区后会出现痛觉减退甚至消失的现象,提示IC在痛觉感知和调控中可能扮演着重要的角色。神经病理性痛所伴随负性情绪的产生和维持可能需要边缘系统内杏仁核参与,它可划分为内侧的杏仁中央核(central amygdaloid nucleus,Ce A)以及外侧的杏仁外侧核(lateral amygdaloid nucleus,LA)/杏仁基底外侧核(basolateral amygdaloid nucleus,BLA)。皮层与杏仁核之间的联系主要通过BLA介导,干预内侧前额叶皮质(medial prefrontol cortex,m PFC)-BLA神经通路可以调控动物的焦虑和恐惧记忆。然而IC-BLA间是否也存在类似的纤维联系?若存在,那么此通路在慢性痛,尤其是神经病理性痛状态下究竟发生何种改变?它是否也参与神经病理性痛及其伴随的负性情绪的调控?鉴于此,本研究综合利用形态学、分子神经生物学、电生理学和行为学等方法,研究了IC-BLA通路在神经病理性痛状态下的形态和功能可塑性改变,同时在上述基础上进一步应用光遗传学和化学遗传学干预IC-BLA神经通路并观察对神经病理性痛的调控作用。分为以下四个部分进行探讨:1.大鼠IC的传入和传出神经纤维联系(1)IC的传入神经纤维联系研究:将逆行示踪剂荧光金(Fluoro-Gold,FG)分别注射入大鼠前部IC(anterior insular cortex,AIC)或后部IC(posterior insular cortex,PIC)。标记结果可在切片后直接观察或行免疫组化染色后观察。结果可见FG逆标神经元主要分布于对侧IC、同侧初级运动皮层(primary motor cortex,M1)、腹侧眶皮层(ventral orbital cortex,VO)、丘脑中线核团、BLA、黑质致密部(substantia nigra,compacta part,SNC)、被盖腹侧区(ventral tegmental area,VTA)、中缝背核(dorsal raphe nucleus,DR)、臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)、蓝斑(locus coeruleus,LC)等脑区和核团。(2)IC的传出神经纤维联系研究:将顺行示踪剂植物凝集素(Phaseolusvulgaris-leukoagglutinin,PHA-L)分别电泳注射入AIC或PIC。动物存活2 w后,先灌注固定,再行免疫组化染色,在显微镜下观察IC的传出纤维所到达的脑区或核团。结果可见PHA-L顺标的神经纤维和终末主要分布于对侧IC、同侧背外侧眶皮层(dorsolateral orbital cortex,DLO)、边缘前皮质(prelimbic cortex,Pr L)、伏核中央部(accumnens nucleus,core,Acb C)、BLA、丘脑背内侧核(mediodorsal thalamic nucleus,MD)、丘脑中央内侧核(central medial thalamic nucleus,CM)、以及尾侧的丘脑腹后核小细胞部(ventral posterior thalamic nucleus,parvicellular part,VPCC)、同侧的下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area,LH)、导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)、对侧中缝大核(raphe magnus nucleus,RMg)、孤束核(nucleus of the solitary tract,Sol)、三叉神经脊束核尾侧亚核(trigeminal caudal subnucleus,Vc)等。(3)向IC投射神经元的神经化学解剖学特点:利用免疫荧光双标染色方法观察了DR、LC、SN/VTA等区域内经典神经递质与FG逆标神经元的共存关系。结果显示DR内FG逆标神经元大部分含有5-羟色胺(5-HT)(89.8%);LC内全部FG逆标神经元都表达儿茶酚胺能神经元的标志物络氨酸羟化酶(TH)故向IC投射的LC神经元全部含有去甲肾上腺素(NE);在SN/VTA区可见约91.3%的FG逆标神经元呈TH阳性,表明它们含有多巴胺(DA)。以上结果提示IC可以接受来自丘脑中线核团的感觉信息传入,同时向脑内许多痛觉调控相关脑区和核团发出纤维投射。另外,许多经典神经递质可能都参与调控IC内的神经信息传递。2.神经病理性痛状态下IC-BLA通路的形态学改变(1)神经病理性痛大鼠对侧IC内Fos蛋白表达明显上调:利用坐骨神经选择性损伤(spared nerve injury,SNI)建立大鼠神经病理性痛模型。在该类模型动物上可以观察到双侧IC内表达Fos蛋白的神经元数量均增加,尤以对侧为著,提示神经病理性痛状态下IC内大量神经元被激活。(2)神经病理性痛刺激激活大鼠IC-BLA通路:将逆行示踪剂注射入大鼠BLA,可见FG逆标神经元广泛分布于IC内,主要位于III或V层,由前部向后部逐渐增多,且浅层所占比例逐渐升高。为了进一步观察IC-BLA投射神经元所含有的神经活性物质,又利用原位杂交结合免疫荧光三重标记的方法观察到IC向BLA投射的FG逆标神经元全部表达VGlu T1(vesicular glutamate transporter 1,VGlu T1),且大部分VGlu T1/FG双标神经元表达Fos,提示神经病理性痛能够激活谷氨酸能IC-BLA投射神经元。(3)神经病理性痛状态下大鼠IC神经元的突触可塑性改变:为了在超微结构水平进一步观察IC-BLA投射神经元在神经病理性痛状态下发生的变化,利用包埋前染色方法在电镜下观察了神经病理性痛后IC神经元突触后谷氨酸α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体亚型Glu R1与突触后膜间的关系。同时利用Western blot检测了突触后致密物质(PSD)内Glu R1和谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体磷酸化(p NR2B)的水平。结果显示神经病理性痛使纳米金颗粒标记的Glu R1出现明显的上膜(insertion)现象;Western blot检测说明PSD内Glu R1和p NR2B的表达均显著升高。上述结果提示神经病理性痛状态下IC内投射神经元发生了形态可塑性改变,主要表现为AMPA受体上膜和NMDA受体的磷酸化增加的现象。上述结果提示神经病理性痛可以使谷氨酸能IC-BLA兴奋性投射神经元的活性增强、IC-BLA投射神经元的突触后Glu R1出现上膜现象和PSD内Glu R1和p NR2B的表达明显升高。这些结果揭示了IC-BLA投射神经元在分子水平发生的可塑性改变。3.神经病理性痛状态下IC-BLA通路的电生理学研究为了从电生理角度阐明神经病理性痛状态下IC-BLA投射神经元发生的改变,将四甲基罗达明(TMR)注射入大鼠BLA以标记IC向BLA投射神经元,在离体脑片上钳制TMR逆标神经元并进行记录。(1)神经病理性痛明显增加IC-BLA投射神经元的自发兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,s EPSCs)的频率和幅值:在电压钳模式下,神经病理性痛组s EPSCs的频率和幅值都明显高于假手术(Sham)组,提示IC-BLA投射神经元经突触终末前释放的递质增多,突触后受体的反应性增强。(2)神经病理性痛明显增强IC-BLA投射神经元的兴奋性:在电流钳记录模式下,进一步检测了IC-BLA投射神经元的固有兴奋性改变。结果显示SNI后,IC-BLA投射神经元在给予一串外源性电流(400 ms,10-90 p A)刺激的情况下,动作电位的发放数目明显多于Sham组,提示神经元的固有兴奋性增强。(3)IC-BLA投射神经元兴奋性突触传递在SNI后明显增强:与Sham组相比,SNI后AMPA受体Input(刺激强度)-Output(EPSC幅度)曲线斜率明显增加,提示神经病理性痛状态下AMPA受体所介导的兴奋性突触传递明显增强。同样,如在灌流液中加入AMPA受体阻断剂CNQX之后,再观察NMDA受体的反应,结果显示NMDA受体Input-Output曲线斜率也明显增加,提示神经病理性痛状态下NMDA受体所介导的兴奋性突触传递也明显增强。上述结果说明神经病理性痛状态下IC-BLA投射神经元的自发放电,固有兴奋性以及兴奋性突触传递均增强。4.IC-BLA通路对神经病理性痛信息传递及其伴随负性情绪的调控作用最后,利用光遗传学和化学遗传学的方法特异性操控IC-BLA通路的活性,观察此通路对神经病理性痛及其伴随负性情绪的调控作用。进行光遗传实验时,将AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP/AAV-Ca MKII-e YFP病毒注射入小鼠双侧PIC,在双侧BLA埋置光纤,6 w后蓝光刺激双侧BLA并进行von Frey纤维丝机械性痛阈值检测、旷场试验和高架十字迷宫试验。在进行行为学实验前,先在离体脑片上记录并确认IC内被感染神经元可以被蓝光诱发动作电位,另外,蓝光照射也能够诱发BLA神经元的EPSC。进行化学遗传学实验时,将AAV-h Syn-DIO-HM4Di-m Cherry/AAV-h Syn-DIO-m Cherry病毒注射入Ca MKII-Cre小鼠双侧PIC,在双侧BLA埋管,6 w后经埋管向双侧BLA给予CNO,1 h后进行von Frey纤维丝机械性痛阈值检测,旷场试验和高架十字迷宫试验。(1)蓝光刺激可以诱发离体脑片的动作电位和兴奋性突触后电流:在IC深层(V层)钳制并记录荧光标记的神经元,采用5 Hz和10 Hz的蓝光刺激都能成功诱发动作电位(action potential,AP)发放。在BLA纤维密集区周围钳制并记录锥体神经元的EPSC,给予同样条件的蓝光刺激可见5 Hz及10 Hz都能成功激发出EPSC,在灌流液中加入AMPA受体阻断剂CNQX(10μM),则几乎能完全使激发出的EPSC消失。上述结果提示蓝光刺激可以诱发BLA神经元的EPSC,且此电流由谷氨酸能的AMPA受体介导。(2)使用光遗传学技术激活IC-BLA通路可促痛并导致动物出现焦虑抑郁样负性情绪:蓝光刺激双侧BLA可以明显降低AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染小鼠的后足机械性缩足阈值。此外,旷场试验结果显示当蓝光刺激双侧BLA时,可见AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染组小鼠的中央区活动时间占总时间百分比(Center time%)明显低于对照组;高架十字迷宫实验结果显示AAV-Ca MKII-Ch R2-e YFP感染组小鼠的开放臂进入次数占总次数百分比(OA entries%)以及开放臂活动时间占总时间百分比(OA times%)低于e YFP对照组,上述结果说明小鼠出现明显的焦虑抑郁样行为。(3)通过化学遗传学方法抑制IC-BLA通路可以部分逆转神经病理性痛并缓解焦虑抑郁样负性情绪:双侧BLA给予CNO 1 h后,AAV-h Syn-DIO-HM4Di-m Cherry(HM4Di)注射组小鼠的机械性痛阈值明显升高,与AAV-h Syn-DIO-m Cherry(m Cherry)对照组小鼠相比有统计学差异,此结果提示特异性抑制IC-BLA通路可以缓解神经病理性痛。此外,旷场试验结果显示HM4Di组较m Cherry对照组的Center time%增加;高架十字迷宫试验结果显示SNI明显减少小鼠的OA entries%和OA time%,上述结果表明特异性抑制IC-BLA通路可以缓解焦虑抑郁样情绪。以上结果说明激活IC-BLA通路可以降低小鼠机械性痛阈值,出现焦虑抑郁样行为;反之抑制IC-BLA通路则可以缓解神经病理性痛及其伴随的焦虑抑郁样负性情绪。总之,上述实验结果说明:(1)IC在中枢内具有广泛的神经纤维联系;(2)从IC向BLA存在直接的神经纤维联系,即存在IC-BLA通路;(3)IC-BLA通路在神经病理性痛状态下出现异常的活动性增强,使IC投射神经元发生形态和功能可塑性改变,并加重神经病理性痛;(4)特异性抑制IC-BLA谷氨酸能兴奋性通路可以缓解神经病理性痛及其伴随的负性情绪。