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目的:细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内错误折叠蛋白进行降解的重要过程,在癌症细胞中尤为活跃。在人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z中,由于癌细胞无限增殖的特性,细胞长期处于饥饿状态中,细胞自噬活动增强。我们实验室前期研究证明,鼻咽癌细胞中ClC-3氯离子通道表达增加,功能活性增强。基于此,本课题使用EBSS诱导细胞饥饿后观察细胞自噬,探讨ClC-3氯离子通道是否参与饥饿诱导的细胞自噬,为日后进行鼻咽癌的临床治疗提供实验基础。方法:本实验以人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z为研究对象,进行下述实验。1)全细胞膜片钳记录EBSS激活CNE-2Z细胞的氯电流。2)MDC染色观察细胞内自噬体和酸性溶酶体的表达情况。3)Western Blot检测细胞中ClC-3、自噬底物蛋白P62、自噬标记蛋白LC3的表达。4)siRNA技术沉默ClC-3后,观察细胞的氯电流和P62以及LC3的变化。5)流式细胞仪检测细胞内活性氧ROS的水平。结果:1.EBSS激活鼻咽癌CNE-2Z细胞的外向氯电流的产生,在107.48±21.32min时,EBSS可激活细胞的氯电流,持续作用174.16±18.88 min后,电流达到平台期。在±80mV钳制下记录到电流密度为(48.09±6.41)pA/pF和(-35.36±4.53)pA/pF,EBSS激活的电流具有缓慢平滑增长的趋势,具有明显的外向优势,且不具备时间和电压依赖性失活的特性。其翻转电位为(-9.98±2.64)mV,接近本实验条件下氯离子平衡电位ECl-=-13.5mV。氯通道阻断剂DIDS、NPPB及ClC-3 siRNA均能抑制EBSS激活CNE-2Z的氯电流。2.EBSS促进鼻咽癌细胞CNE-2Z中自噬小体和酸性溶酶体增加。氯通道阻断剂NPPB和DIDS以及ClC-3 siRNA能进一步增加细胞中自噬小体和酸性溶酶体数量。3.EBSS促进鼻咽癌细胞CNE-2Z中ClC-3蛋白表达增加,同时促进自噬底物蛋白P62降解,自噬标记蛋白分子LC3-I转化为LC3-II,促进自噬流的顺利进行。4.氯通道阻断剂NPPB和DIDS以及ClC-3 siRNA均能抑制自噬底物蛋白P62的降解,同时抑制自噬标记蛋白分子LC3-II的降解,抑制自噬流的进行。5.抗氧化剂L-NAC降低鼻咽癌细胞CNE-2Z中水平,抑制ClC-3的表达,抑制自噬底物蛋白P62的降解,同时抑制自噬标记蛋白分子LC3-I转化为LC3-II的过程,表示抑制活性氧水平阻遏ClC-3表达。EBSS诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z中ROS水平增加,而ClC-3下调后对细胞中ROS水平影响不大。结论:ClC-3氯离子通道参与鼻咽癌细胞CNE-2Z中EBSS诱导的细胞自噬;ROS水平上升后,通过上调ClC-3氯离子通道表达,介导EBSS诱导的细胞自噬。