肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员,基因组为单股正链RNA,主要感染5岁以内的婴幼儿。多数EV71感染表现为手足口部的疱疹、皮疹和发热等症状,部分患儿会出现神经系统并发症,甚至会导致死亡。目前对于EV71的致病机制尚不明确,但以往研究表明病毒基因组的多个区域均与病毒复制能力和毒力相关,本课题组之前研究表明EV71的非结构蛋白2A能够影响病毒的复制能力和毒力,但其关键氨基酸位点的精确定位还需进一步研究。本研究通过比较不同毒力表型的EV71毒株中非结构蛋白2A的差异,利用反向遗传学技术构建并拯救突变型毒株,研究2A蛋白的关键氨基酸在EV71致病机制中的作用,为疫苗和药物的研发提供理论基础。目的1.比较两株EV71不同毒力表型株2A片段的氨基酸序列差异,将强毒株2A蛋白的关键氨基酸突变成弱毒株相应位置的氨基酸,构建并拯救突变型毒株。2.比较突变后的病毒与亲本毒株在复制能力、致细胞损伤能力和自噬等方面的差异,探究2A蛋白上的毒力候选位点在EV71致病机制中的作用。方法1.利用重叠融合PCR技术得到突变后的目的片段,将目的片段酶切置换到含有EV71强毒株SDLY107全长的pMD-19-T中,从而得到SDLY107的突变株,通过体外转录获得感染性RNA,转染至RD细胞,拯救成功后的病毒经PCR、间接免疫荧光实验对其进行鉴定,测序验证,CCID50和空斑实验测定病毒滴度。2.使用RD细胞、U87细胞和SH-SY5Y细胞检测突变型毒株和亲本毒株在复制能力、致细胞损伤能力和诱导细胞自噬等方面的差异。结果1.两株不同毒力表型株在2A蛋白上有三个氨基酸突变位点,分别为Y64H(全编码区为Y190H)、M68R(全编码区为M203R)和D85E(全编码区为D255E)。2.成功构建并拯救了三株突变型毒株,并对其滴度进行了测定。3.qRT-PCR实验结果表明,EV71不同毒株感染RD细胞和U87细胞,突变型毒株和亲本毒株之间的复制能力差异不明显,但强毒株SDLY107达到复制高峰期的时间要早于其他毒株,感染SH-SY5Y细胞后,突变型毒株几乎没有复制能力,而强毒株SDLY107具有较强复制能力,弱毒株SDLY1的复制能力弱于SDLY107株。4.LDH实验和CCK8实验检测不同毒株致细胞损伤能力的结果表明,EV71不同毒株感染RD细胞、U87细胞和SH-SY5Y细胞,突变型毒株与亲本毒株相比,其致细胞损伤能力均弱于强毒株SDLY107株(P<0.05)。5.Western Blot实验和免疫荧光实验结果表明,EV71感染细胞能诱导自噬的发生,且EV71不同毒株感染不同细胞后,诱导细胞自噬的能力以及自噬降解机制有差异。结论1.成功构建并拯救了三株突变型毒株,其复制能力在神经细胞上与亲本毒株存在明显差异,表明2A蛋白的第64位氨基酸(Y→H)、第68位氨基酸(M→R)和第85位氨基酸(D→E)均是影响EV71在神经细胞上的复制能力的关键位点,与EV71的神经毒力密切相关。2.突变型毒株感染神经细胞后病毒复制水平降低,同时检测到自噬关键分子信号减弱,自噬过程可能与病毒的复制能力相关。