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目的:ZNF498作为哺乳动物中最大的转录因子/转录调控因子家族中的一员,截止目前尚未有对ZNF498生物学功能和机制的相关报道,因此其生物学功能及所参与的细胞内信号转导路径均不清楚。前期我们实验室揭示了KZNF家族的另一成员Apak的功能机制,发现Apak可以分别作为转录因子和转录调控因子,负调控p53活性。在正常条件下,Apak通过募集KAP1和组蛋白去乙酰化酶与p53发生相互作用,抑制了p53的转录活性和p53介导的细胞凋亡。在应激条件下,Apak与p53解离,激活了p53介导的细胞凋亡。为了进一步了解KZNF家族其他成员的功能机制,我们对KZNF家族成员通过多种方法进行了筛选,筛选出可以负调控p53活性的分子ZNF498。ZNF498有两种转录本ZNF498-1（编码544个氨基酸）和ZNF498-2（编码465个氨基酸）且ZNF498两种isoform（ZNF498两种亚型）结构不同（附图表A）。因此,我们构建了两种亚型的表达质粒Myc-ZNF498-1和Myc-ZNF498-2。此外,前期部分结果证实ZNF498在肝癌组织中高表达,可能与肝癌的发生发展具有一定的相关性。而肝癌作为五大恶性肿瘤中的一员,具有较高的发病率和死亡率,是一种严重危害我国人民生命健康的疾病。因此,对于肝癌的研究已成为刻不容缓之事。我们将主要从分子水平和细胞水平阐明,ZNF498的两种亚型是如何调控p53的活性并参与肝癌的生长,这将为深入理解ZNF498的功能及肝癌发生发展的机制提供重要的实验基础。方法:通过双荧光素酶报告基因实验检测ZNF498过表达对p53活性的影响,通过Western blot和qPCR实验分别检测敲低内源ZNF498对p53靶基因蛋白和RNA水平的影响,以证明ZNF498对p53转录活性的影响。利用免疫共沉淀实验分别检测内、外源ZNF498与p53之间的相互作用及构建ZNF498的截短体检测介导ZNF498与p53相互作用的结构域,以证明ZNF498和p53之间存在相互作用。利用Western blot分别检测过表达和敲低ZNF498后,对p53磷酸化和乙酰化位点的影响,以研究ZNF498对p53翻译后修饰的影响。通过在p53-/-和p53+/+的细胞中,过表达ZNF498后,检测其对细胞凋亡的影响。以及通过构建稳定敲低ZNF498的HepG2细胞系,检测敲低ZNF498后对细胞凋亡的影响,以证明ZNF498对p53介导的细胞凋亡的影响。通过在p53-/-的细胞中过表达野生型p53和p53 S46A突变体,分别检测ZNF498对p53转录活性、细胞凋亡、细胞凋亡相关的靶基因Puma蛋白和RNA水平的影响,以证实ZNF498对细胞凋亡的影响依赖于p53 Ser46的磷酸化修饰。利用构建好的稳定敲低ZNF498的肝癌细胞系,通过CCK8检测细胞增殖和裸鼠成瘤实验检测肿瘤生长。以及通过收集肝癌细胞和组织,利用Western blot技术检测各种肝癌细胞系中ZNF498的表达,以及肝癌组织和相对应的癌旁组织中ZNF498的表达,探讨ZNF498在肝癌发生发展中的作用。结果:两种ZNF498的转录本均可以抑制p53转录活性;在p53野生型的HepG2细胞系中,敲低ZNF498可以特异促进Puma的蛋白水平和RNA水平;而在p53缺失的Hep3b细胞中,ZNF498两个转录本过表达仅可抑制野生型p53过表达上调的Puma的表达。在DNA损伤条件下,ZNF498亦可以抑制p53转录活性,敲低ZNF498后,促进p53靶基因Puma的表达;过表达ZNF498后,发现可以抑制Puma的表达。内源和外源表达的ZNF498与p53可以发生相互作用,ZNF498的锌指结构域介导其与p53发生相互作用,在DNA损伤条件下,ZNF498与p53的相互作用无改变。正常和DNA损伤条件下,ZNF498过表达均可以降低p53 Ser46位的磷酸化水平,但是对p53其他位点的修饰并没有影响;敲低内源的ZNF498后,可以增强p53 Ser46的磷酸化水平。正常和DNA损伤条件下,敲低内源ZNF498促进细胞凋亡,ZNF498抑制细胞凋亡依赖p53。ZNF498依赖对p53 Ser46磷酸化水平的调控,抑制p53的转录活性,抑制下游靶基因Puma表达以及p53介导的细胞凋亡。稳定敲低ZNF498的HepG2细胞增殖能力降低,过表达ZNF498的HepG2细胞系细胞增殖能力增加。稳定敲低ZNF498的HepG2细胞系注射裸鼠背部,发现ZNF498的敲低抑制了肿瘤。多种肝癌细胞系检测到ZNF498的表达;肝癌组织和癌旁组织检测,ZNF498在肝癌组织中高表达;肝癌和癌旁组织芯片分析,ZNF498在肝癌组织中高表达。结论:1.正常条件和DNA损伤条件下,ZNF498抑制p53转录活性,选择性抑制p53凋亡相关靶基因Puma的表达;2.ZNF498可以和p53发生相互作用;3.ZNF498抑制p53 Ser46的磷酸化,但是对p53其他的翻译后修饰没有影响;4.ZNF498依赖p53 Ser46位磷酸化抑制p53转录活性、细胞凋亡和Puma的表达;5.ZNF498在肝癌细胞及组织中表达,ZNF498促进肝癌细胞增殖和肝癌生长。