昆虫中肠是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)发挥作用的主要部位,Bt毒素与昆虫中肠受体的结合是毒素发挥作用所必需的,中肠受体的变化被认为是昆虫产生抗性的主要机制。随着Bt棉的大面积推广,棉铃虫Helicoverpa armigera对Bt毒素产生的抗性将会严重威胁Bt棉长期有效地利用,所以了解Bt抗性的分子机制是非常重要的。为了进一步明确棉铃虫对Bt产生抗性的机制,为制定抗性治理策略和延长Bt棉的使用寿命提供重要的理论依据,我们构建了棉铃虫中肠的cDNA文库;而且通过对文库的筛选,我们发现了很多Vacuolar ATP酶亚基基因;因为已有报道Vacuolar ATP酶B亚基可能是Bt毒素Cry1Ac的结合蛋白,因此我们又克隆了棉铃虫中肠的V-ATP酶亚基B基因,并对其功能进行了初步研究。主要结果如下:1、运用RNA转录过程中的5′末端转换机制(Switching Mechanism at 5′end of the RNA Transcript, SMART)技术构建了棉铃虫中肠的cDNA文库。对该文库质量分析表明:库容量为2×106 pfu/mL,重组率为100%,平均插入片段大于1 kb,全长率为50%,最终成功得到1098条表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)序列,文库的各项指标均达到要求。2、利用兼并引物PCR结合RACE末端特异性扩增技术,克隆了棉铃虫中肠V-ATP酶基因的cDNA序列。该cDNA序列长2091 bp,开放阅读框为1485 bp,编码494个氨基酸,GenBank登录号为GU370066。预测其分子量和等电点分别为55kD和5.26。软件分析表明,V-ATP酶亚基B没有信号肽,也没有发现潜在的C端GPI锚定位点。序列同源性分析发现,该序列与烟芽夜蛾的同源性最高,达99.8%;与人和小鼠相比同源性也很高,分别达85.2%和81.3%。说明V-ATPase亚基B基因非常保守。3、将V-ATPase亚基B基因进行了原核表达,将表达的蛋白分别与Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1C、Cry1B毒素进行Ligand blot试验,结果发现表达蛋白可以与Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1C毒素结合,而不能与Cry1B结合。证明V-ATPase亚基B基因是部分Bt毒素的结合蛋白。用表达蛋白与Cry1Ac毒素混合后饲喂棉铃虫幼虫,生物学测定结果表明,与单独取食Cry1Ac毒素的棉铃虫相比,取食含有V-ATP酶亚基B表达蛋白与Cry1Ac毒素混合液的幼虫体重差异不明显。因此,虽然V-ATP酶亚基B基因是Cry1Ac等毒素的结合蛋白,但原核表达后的蛋白对Cry1Ac的毒力效果并没有明显影响。4、荧光定量PCR结果表明,不同发育时期V-ATP酶亚基B基因的表达量不同,成虫的表达量最高,其次是幼虫,在蛹中的表达量最低。在肠道不同部位的的表达量也有一定的差异,前肠与中肠表达量的差异不显著,但明显比后肠的表达量高。不同品系V-ATP酶亚基B基因的表达量差异较大,敏感品系的表达量明显高于Cry1Ac抗性品系。V-ATP酶亚基B基因的表达量是否与棉铃虫对Cry1Ac产生抗性相关有待进一步验证。