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FHL2(Four and a half LIM domains protein 2)基因是FHL基因家族中研究最多的一位成员,FHL2不仅可以结合不同转录因子调控相关基因表达,而且对于细胞信号转导通路也有重要调控作用。研究表明FHL2在人卵巢颗粒细胞瘤细胞中表达,转化生长因子-α(Transforming growth factor-α,TGF-α)可通过PI3K/AKT和MAPK信号通路调控人卵巢颗粒细胞瘤细胞KGN增殖。但FHL2对KGN细胞的调控作用、TGF-α与FHL2互作、以及该互作对颗粒细胞的调控作用尚不清楚。本课题以KGN为模型,对上述问题予以探究。本研究结果将为深入了解卵泡发育和卵泡发育的调控机制提供新的理论基础,同时为卵泡发育相关信号转导通路提供新的研究思路。主要研究结果如下:1.FHL2调控KGN细胞的增殖、周期及TGF-α的表达干扰KGN细胞中FHL2的表达后,分别利用CCK-8试剂盒、流式细胞术以及RT-PCR检测FHL2对细胞增殖、周期的影响以及对TGF-α的表达调控:1)CCK-8法检测细胞增殖结果显示,FHL2干扰组细胞存活率(1.00±0.01 vs0.32±0.05,p<0.001)显著降低;细胞计数法检测细胞数量比值发现,FHL2干扰组细胞数比值显著低于对照组(1.00±0.01 vs 0.44±0.10,p<0.05),表明FHL2knockdown能够抑制细胞增殖;2)流式细胞仪检测细胞周期结果显示,干扰FHL2表达后,S期细胞比例显著降低(13.17±0.13 vs 8.90±0.04,p<0.001),提示FHL2可阻滞细胞周期;3)RT-PCR检测结果显示,干扰FHL2后,TGF-α(1.03±0.10 vs 0.19±0.01,p<0.001)及其受体EGFR(1.08±0.12 vs 0.70±0.30,p<0.05)表达量均降低。2.TGF-α促进KGN细胞增殖用TGF-α处理KGN细胞后,通过细胞计数法检测细胞的增殖情况。结果显示,TGF-α处理组细胞数显著高于对照组(92.67±11.55 vs 149.00±8.89,p<0.001),表明TGF-α促进KGN细胞增殖。3.TGF-α调控卵巢颗粒细胞中FHL2、EGFR、TGF-α的表达用TGF-α处理KGN细胞后,通过RT-PCR的方法检测FHL2、EGFR和TGF-α基因的表达水平,结果显示,TGF-α能够上调FHL2(1.00±0.08 vs 2.16±0.29,p<0.001)、EGFR(1.02±0.22 vs 2.01±0.13,p<0.001)及TGF-α基因的表达(1.03±0.10vs 2.08±0.03,p<0.01);当干扰FHL2后再添加TGF-α处理细胞,结果显示FHL2(2.16±0.29 vs 0.26±0.01,p<0.001)、EGFR(2.01±0.13 vs 0.78±0.05,p<0.001)和TGF-α(2.08±0.03 vs 1.16±0.19,p<0.001)的表达水平均下调。这说明TGF-α能够上调FHL2、EGFR和TGF-α基因的表达,而抑制FHL2的表达后该上调作用不明显。4.TGF-α可通过MAPK通路调控FHL2表达分别用信号通路抑制剂U0126、LY294002、AG1478处理KGN细胞3h后,再添加TGF-α培养KGN细胞,通过RT-PCR检测FHL2、EGFR和TGF-α的表达水平。结果发现:1)MEK蛋白抑制剂处理后再添加TGF-α,与对照组相比,FHL2(2.16±0.29 vs0.79±0.07,p<0.001)、EGFR(1.84±0.20 vs 0.68±0.04,p<0.001)以及TGF-α(1.46±0.32 vs 0.52±0.25,p<0.01)的表达水平均下调;2)PI3K蛋白抑制剂处理后再添加TGF-α,与对照组相比,FHL2(2.16±0.29 vs1.79±0.11,p>0.05)的表达无显著差异,而EGFR(1.84±0.20 vs 0.90±0.27,p<0.01)和TGF-α(1.46±0.32 vs 0.28±0.01,p<0.01)的表达水平降低;3)EGFR抑制剂处理细胞后再添加TGF-α,与对照组相比,FHL2(2.16±0.29 vs1.26±0.02,p<0.05)、EGFR(1.84±0.20 vs 1.32±0.11,p<0.01)以及TGF-α(1.46±0.32vs 0.28±0.24,p<0.01)的表达水平均显著降低。该结果表明,TGF-α与其受体EGFR结合后,通过MAPK信号通路参与对FHL2的表达调控。5.TGF-α/EGFR/FHL2形成自分泌通路调控KGN细胞的增殖本研究以人卵巢颗粒细胞瘤细胞系KGN为模型,研究了颗粒细胞中TGF-α与FHL2互作及其对KGN细胞生长的调控作用和机制。结果发现:FHL2可能通过与转录因子结合调控TGF-α及其受体EGFR表达,而TGF-α对KGN细胞的增殖具有重要调控作用,TGF-α通过与EGFR结合,激活MAPK信号通路调控FHL2的表达。TGFa/EGFR/FHL2形成了自分泌调控通路,参与KGN细胞生长调控。