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芳香化合物是一类工业用途极其广泛的化合物,可以通过多种途径进入环境,造成对水体、土壤和大气的污染。综合考虑经济成本及处理工艺等因素,微生物修复法成为芳香污染物去除的有效途径之一。其中,间位开环断裂途径广泛存在于芳香化合物的微生物代谢过程,其关键步骤是间位开环产物水解酶对上游代谢产物的水解反应。天然间位开环产物水解酶的底物选择性极其严格,因此,这一步骤成为整个代谢途径的限速步骤。本论文以联苯好氧代谢途径中的间位开环产物水解酶为研究对象,通过探索其结构域及非活性位点残基对底物特异性和催化效率的影响,揭示底物特异性的分子结构基础;证明间位开环产物水解酶具有催化混杂性,扩宽了其在生物催化领域的应用范围;利用两种不同类型的纳米材料作为载体,探索固定化间位开环产物水解酶的活性及稳定性差异。 从联苯代谢菌株Dyella ginsengisoli LA-4中克隆编码间位开环产物水解酶的基因bphD,并在大肠杆菌中实现其编码产物BphD的异源表达。BphD对C6原子带有苯环取代基的底物HOPDA具有非常强的底物特异性,归属于GroupⅠ型间位开环产物水解酶。其催化最适温度和pH分别为55℃和6.5。通过同源模建方法构建了BphD的三维结构模型,确认了其具有α/β水解酶家族典型的lid结构域和core结构域。其催化三联体为Ser112-Asp237-His265。利用分子对接分析了BphD和本实验室先前获得的间位开环产物水解酶MfphA的底物选择性机制,揭示了活性位点内非保守残基具有的空间位阻和氢键作用的重要性。 采用同源重组的方法研究不同结构域对于底物特异性的影响。根据序列能量分析和分子动力学模拟,确定了合适的重组位点,分别为BphD上的Gly136和Ala211,以及MfphA上的Gly130和Ala196。通过该方法获得的杂合酶的催化特异性与提供lid结构域的母本酶类似,表明lid结构域在决定间位开环产物水解酶的底物特异性中扮演着重要的角色。进一步的分子对接结果表明GroupⅡ型缺失的一段不规则卷曲结构(对应于BphDLA-4中的Ala208-Ser214)对于HOPDA的催化可能有较为重要的影响。 进一步探索了非活性位点氨基酸残基在催化过程中的作用。根据氨基酸保守性分析和静态结构的通道识别,选择了通道入口的Met148作为突变位点。利用饱和突变构建了19种可能的突变体,其中M148P的催化效率比野生酶下降了74倍,而具有最大侧链位阻的M148W的催化效率与野生酶接近。分子动力学模拟表明M148W中的对应通道被完全的堵塞,其活性没有明显下降的原因是该通道并非HOPDA进入活性口袋的主要通道。而M148P活性急剧下降的主要原因是涉及底物有效结合的两对氢键相互作用缺失。 考察MCP水解酶的催化混杂性。BphD和MfphA均可以催化特定对硝基苯基羧酸酯的水解反应,且反应的催化特异性参数与MCP水解反应处于同一数量级。MfphA不能催化具有苯环取代基的PNPBen反应的原因与底物苯环取代基的大位阻、Ser106和底物酚羟基之间产生的不合理氢键相互作用有关。BphD可用于催化TEOS的水解反应,但是该反应不属于活性位点依赖的反应。同时,BphD在PBS缓冲溶液中,可以利用钛前驱体Ti-BALDH合成NASICON型化合物NaTi2(PO4)3,具有潜在的应用价值。该反应同样不是活性位点依赖的反应,而是依靠表面荷正电的残基对H2PO4-的强吸引力实现。 利用滴定曲线及蛋白质表面电荷分布预测MfphA和BphD的最适固定化pH范围,并通过吸附动力学实验得以证实。在测试条件下,利用SBA-15固定化的MfphA的负载量为34 mg/g,不同底物存在下最高的保留活性仅为25%;而BphD的负载量为27 mg/g,并且完全丧失了对底物的催化能力。而利用原始和经羧基修饰的CNTs对MfphA和BphD进行固定化,负载量可提升至276-508mg/g,为对应的SBA-15负载量的10倍以上。同时,利用羧基修饰的SWCNT可以保留93.2%的BphD的活性,而SWCNT完全抑制了MfphA的活性。分子动力学模拟表明SWCNT对MfphA的抑制机制为堵塞蛋白质分子的底物通道。