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目的:探讨衰老血管内皮细胞是否可以通过外泌体介导miRNAs调节皮肤成纤维细胞的衰老进程,并进一步分析衰老血管内皮细胞来源的外泌体miRNAs调节皮肤成纤维细胞衰老的具体分子机制。方法:1.首先,建立D-半乳糖诱导的血管内皮细胞衰老模型,采用β-半乳糖苷酶染色法以及RT-qPCR法检测衰老相关基因p53的表达,分析血管内皮细胞衰老情况。然后,通过Transwell小室建立血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养体系,以分析与衰老血管内皮细胞共培养后的皮肤成纤维细胞的生物学功能变化情况。接着,通过β-半乳糖苷酶染色法分析共培养后皮肤成纤维细胞衰老的变化情况,采用Hoechst染色分析细胞凋亡情况,采用Ki67染色分析细胞增殖功能。2.首先,根据课题组前期对衰老皮肤组织的miRNA芯片分析获得的衰老相关miRNAs,分析单独培养的衰老血管内皮细胞以及单独培养的皮肤成纤维细胞中衰老相关miRNAs的表达情况,并结合血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养模型,筛选兴趣miRNAs。接着,采用SBI外泌体提取试剂盒分离提取内皮细胞源性外泌体并进行鉴定后,分析衰老血管内皮细胞外泌体中兴趣miRNAs的表达情况;并采用CD63-GFP慢病毒转染建立CD63-GFP表达的内皮细胞模型,结合Cy3-特异性miRNA转染技术,对血管内皮细胞来源的外泌体及相关miRNAs进行示踪分析,追踪其被皮肤成纤维细胞摄取的效果。最后,分别提取未衰老的血管内皮细胞外泌体与衰老的血管内皮细胞外泌体直接干预皮肤成纤维细胞,通过β-半乳糖苷酶染色法分析共培养后皮肤成纤维细胞衰老的变化情况,采用Hoechst染色分析细胞凋亡情况,以进一步明确衰老血管内皮细胞外泌体对皮肤成纤维细胞生物学功能的影响。3.采用脂质体瞬时转染方法,分别将miR-326-3p及miR-767miRNA mlrnic或miRNA inhibitor转染皮肤成纤维细胞,建立兴趣miRNA过表达或低表达细胞模型,采用RT-qPCR法分析miRNA mimic或miRNA inhibitor转染后皮肤成纤维细胞兴趣miRNAs的表达,以明确miRNA mimic或miRNA inhibitor的转染效果。然后,通过β-半乳糖苷酶染色法分析共培养后皮肤成纤维细胞衰老的变化情况,采用Hoechst染色分析细胞凋亡情况,采用Ki67染色分析细胞增殖功能,分析特异性miRNA mimic或miRNA inhibitor转染后皮肤成纤维细胞的生物学功能。4.上调或下调原代皮肤成纤维细胞中microRNA表达,并用RT-qPCR检测其表达改变。利用生物信息学软件Targetscan预测分析miR-326-3p和miR-767的靶基因,并通过RT-qPCR法及以及Western blot法初步分析兴趣miRNA与靶基因的相关关系。最后,通过双荧光素酶报告基因实验检测明确miR-326-3p与靶基因TLR4的靶向关系和miR-767与靶基因TAB1的靶向关系。结果:1.本研究首先通过D-半乳糖诱导法建立血管内皮细胞衰老模型,与对照组相比,20g/L的D-半乳糖诱导血管内皮细胞48 h后,衰老染色的阳性细胞数目及p53mRNA表达基因显著增多(p<0.01)。然后,通过Transwell小室建立内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养体系,分别观察未衰老血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养组(Control)、衰老血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养组(Model)、(衰老血管内皮细胞+GW4869)与皮肤成纤维细胞共培养组(Model+GW),共培养48h后,与对照组比较,Model组中皮肤成纤维细胞出现衰老染色阳性细胞数量显著增多(p<0.01),细胞凋亡染色阳性细胞数显著增多(p<0.001);细胞Ki67增殖染色阳性细胞数显著减少(p<0.001);然而,当衰老内皮细胞加入外泌体抑制剂GW4869后,(Model+GW)组皮肤成纤维细胞的衰老、凋亡及增殖染色阳性细胞数量无显著变化。2.衰老相关miRNAs筛选结果显示,与对照组相比,在单独培养的衰老血管内皮细胞中miR-326-3p和miR-767表达显著升高(p<0.05);在单独培养的衰老皮肤成纤维细胞中miR-326-3p和miR-767的表达显著降低(p<0.05)。然而在血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养体系中,与对照组比较,Model组中皮肤成纤维细胞miR-326-3p、miR-767表达显著升高。然后,分离提取内皮细胞培养上清液中的外泌体并进行鉴定,在超微电镜下可观察到提取物中呈“茶托状”的囊泡,直径约为60nm,Nano粒径分析显示提取物的直径主要集中在40nm～1OOnm。接着,通过SBI试剂盒分别提取未衰老血管内皮细胞与衰老血管内皮细胞培养上清液的外泌体直接干预皮肤成纤维细胞,与未衰老血管内皮细胞外泌体(EXO-control,Exo-c)相比,衰老内皮细胞外泌体(EXO-senescence,Exo-s)中的miR-326-3p、miR-767也显著升高。最后,我们将CY3-miR-326-3p转染至GFP-CD63标记的内皮细胞,示踪分析结果显示共培养后皮肤成纤维细胞可同时出现GFP-CD63的绿色荧光及miR-326-3p的红色荧光。更有趣的是,以加入未衰老血管内皮细胞来源的外泌体作为对照组(Exo-c),加入衰老血管内皮细胞外泌体(Exo-s)不仅可以使皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数显著增多(p<0.001),还可以促进皮肤成纤维细胞凋亡细胞数的显著增加(p<0.001),提示内皮细胞可通过外泌体途径介导miRNAs调控皮肤成纤维细胞的衰老进程。3.通过将miRNA-326-3p mimic或miRNA inhibitor转染皮肤成纤维细胞,可以显著增加或降低皮肤成纤维细胞中miRNA-326-3p的表达水平。采用β-半乳糖苷酶衰老染色法分析细胞的衰老情况,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-326-3p mimic后皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数目显著增多(p<0.01);与对照组(NC-inhibitor)比较,转染 miR-326-3p inhibitor后皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数目显著减少(p<0.05)。采用Hoechst凋亡染色分析细胞凋亡情况,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-326-3p mimic的皮肤成纤维细胞的凋亡染色阳性细胞数目显著增多(p<0.01);与NC-inhibitor对照组比较,转染miR-326-3p inhibitor的皮肤成纤维细胞的凋亡染色阳性细胞数目显著减少(p<0.05)。采用Ki67增殖检测试剂盒分析细胞增殖功能情况,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-326-3p mimic后皮肤成纤维细胞Ki67增殖染色细胞数目显著减少(p<0.001);与对照组(NC-inhibitor)比较,转染miR-326-3p inhibitor后皮肤成纤维细胞的Ki67增殖细胞数目无显著变化。将miRNA-767 mimic或miRNA inhibitor转染后,可以显著增加或降低皮肤成纤维细胞中miRNA-767的表达水平。采用β-半乳糖苷酶衰老染色法分析细胞的衰老情况,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-767 mimic后皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数目显著增多(p<0.05);与对照组(NC-inhibitor)比较,转染miR-767 inhibitor后皮肤成纤维细胞的衰老阳性细胞数目显著减少(p<0.05)。采用Hoechst凋亡染色分析细胞凋亡情况,结果显示,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-767 mimic的皮肤成纤维细胞的凋亡染色阳性细胞数目显著增多(p<0.001);与NC-inhibitor对照组比较,转染miR-767 inhibitor的皮肤成纤维细胞的凋亡染色阳性细胞数目显著减少(p<0.01)。采用Ki67增殖检测试剂盒分析细胞增殖功能情况,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-767 mimic后皮肤成纤维细胞Ki67增殖染色细胞数目显著减少(p<0.001);与对照组(NC-inhibitor)比较,转染miR-767 inhibitor后皮肤成纤维细胞的Ki67增殖细胞数目无显著变化。4.通过生物信息学软件Targetscan对miR-326-3p和miR-767的靶基因进行预测分析结果表明,miR-326-3p 可与 TLR4(Toll-like receptors 4,TLR4)的3’-UTR靶向结合,miR-767可与TAB1的3’-UTR靶向结合。采用miR-326-3p mimic和miR-326-3p inhibitor分别转染皮肤成纤维细胞后,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-326-3p mimic后皮肤成纤维细胞TLR4 mRNA表达显著降低(p<0.05),并且TLR4蛋白表达降低;然而,与对照组(NC-inhibitor)比较,转染miR-326-3p inhibitor后皮肤成纤维细胞TLR4 mRNA基因表达显著升高(p<0.05),并且TLR4蛋白表达升高。采用miR-767 mimic和miR-767inhibitor转染皮肤成纤维细胞后,与对照组(NC-mimic)比较,转染miR-767 mimic后皮肤成纤维细胞TAB1 mRNA基因表达显著降低(p<0.001),并且TAB1蛋白表达降低;然而,与对照组(NC-inhibitor)比较,miR-767 inhibitor转染后皮肤成纤维细胞TAB1 mRNA基因表达显著升高(p<0.001),并且TAB1蛋白表达升高。此外,双荧光素酶报告实验表明miR-326-3p mimic/TLR4 WT共转染组荧光值显著降低而miR-326-3p mimic/TLR4MUT共转染组荧光值与对照组比较无显著差异,提示TLR4是miR-326-3p的直接靶基因;miR-767 mimic/TAB1 WT共转染组荧光值显著降低,而miR-767 mimic/TAB1 MUT共转染组荧光值与对照组比较无显著差异,提示TAB1是miR-767的直接靶基因。结论:1.通过血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞共培养体系发现,血管内皮细胞可能通过外泌体途径调节皮肤成纤维细胞的衰老进程。2.衰老内皮细胞外泌体miR-326-3p与miR-767具有加速皮肤成纤维细胞衰老,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖的可以被皮肤成纤维细胞摄取,并调节细胞的生物学功能。3.miR-326-3p与miR-767具有调节皮肤成纤维细胞凋亡及增殖功能,加速皮肤成纤维细胞衰老的作用。4.本研究证实,miR-326-3p可以直接靶向抑制TLR4靶基因的表达;miR-767可以直接靶向抑制靶基因TAB1的基因表达。