【摘 要】
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目的:尼帕病毒（Nipah virus,NiV）于1998年首次在马来西亚发现,后相继在东南亚国家流行,引起严重的人类呼吸系统和神经系统相关的疾病,病死率高达32-70%,被确定为生物安全4级病原体。NiV自然宿主为果蝠,目前在我国虽尚未发现NiV感染病例,但我国毗邻东南亚国家且在我国西南地区发现果蝠的分布,有NiV输入的风险。目前对于NiV感染尚无有效的药物和治疗方法用以控制,并且NiV自然宿主
【基金项目】
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国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”病毒性传染病病原谱和病毒基因变异变迁规律研究（2018ZX10713-002）；
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目的:尼帕病毒（Nipah virus,NiV）于1998年首次在马来西亚发现,后相继在东南亚国家流行,引起严重的人类呼吸系统和神经系统相关的疾病,病死率高达32-70%,被确定为生物安全4级病原体。NiV自然宿主为果蝠,目前在我国虽尚未发现NiV感染病例,但我国毗邻东南亚国家且在我国西南地区发现果蝠的分布,有NiV输入的风险。目前对于NiV感染尚无有效的药物和治疗方法用以控制,并且NiV自然宿主分布广泛,给人类健康带来巨大的威胁,建立安全可靠的NiV病原学检测方法,对于NiV的早期筛查和传染病防控极为必要。研究方法:本研究针对NiV入侵宿主起关键作用的F蛋白和G蛋白,使用慢病毒载体系统构建NiV假病毒,优化包装体系。假病毒超速离心纯化后,采用免疫学方法和透射电镜观察鉴定假病毒包装;Reed-Muench法计算假病毒TCID50,建立血清中和抗体检测方法。利用大肠杆菌系统表达NiV N蛋白,镍柱亲和纯化N蛋白并免疫小鼠,免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0使用PEG融合后ELISA方法对阳性单克隆细胞株进行筛选,杂交瘤细胞注射小鼠腹腔制备腹水并用Protein G柱纯化获得纯化单克隆抗体,将其鉴定并分型。单克隆抗体和多克隆抗体配对建立检测NiV抗原的双抗体夹心ELISA方法,评价灵敏度和特异性。单克隆抗体配对建立胶体金免疫层析方法,评价此方法的灵敏度和特异性。结果:1、NiV假病毒成功包装及建立血清中和抗体检测方法:（1）成功构建NiV F和G蛋白表达质粒pc DNA3.1-F和pc DNA3.1-G,利用慢病毒载体ps PAX2和辅助质粒Lenti CMV Puro Lu C（w168-1）包装NiV假病毒,优化假病毒包装条件为骨架质粒ps PAX2、辅助质粒w168-1和膜蛋白F与G质粒最适质量比为4:4:1:1。（2）Western Blot方法和间接免疫荧光均验证NiV假病毒成功表达NiV F和G蛋白与HIV p24蛋白,透射电镜观察可见直径约100-200nm圆形或椭圆形颗粒,周围有包膜,膜上有刺突,证实假病毒成功包装。（3）假病毒滴度为4.73×10~5TCID50/m L,293T细胞为NiV假病毒感染的敏感细胞。（4）NiV假病毒可以有效中和F和G蛋白的血清抗体,成功建立了基于假病毒的中和抗体检测方法。2、NiV N蛋白单克隆抗体制备及免疫学检测方法的建立:（1）利用大肠杆菌系统成功表达NiV N蛋白,Ni-NTA纯化并超滤浓缩后,N蛋白经BCA定量含量为1.43mg/m L。（2）N蛋白免疫小鼠,杂交瘤技术融合后筛选获得3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株,分别为2A5、4A11和5B2。制备腹水并用Protein G柱纯化获得纯化单克隆抗体。单抗亚型鉴定重链均为Ig G1型、轻链均为kappa链,效价均＞1:1000000且Western Blot方法鉴定3株单抗均可以和真核表达N蛋白特异性结合。（3）建立基于自备的2A5单克隆抗体和兔多克隆抗体的ELISA双抗体夹心法,最优条件确定单抗的最佳包被浓度为0.625μg/m L,多抗稀释度为1:4000,此条件真核蛋白抗原检出灵敏度为5ng/m L,其它呼吸道病毒均为阴性结果,具有较好的特异性。（4）选择2A5单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,建立胶体金免疫层析检测方法,真核蛋白抗原检出灵敏度为300ng/m L,呼吸道病毒均为阴性结果,特异性较好。结论:1、利用慢病毒载体成功包装NiV假病毒,并建立血清中和抗体检测方法。2、利用大肠杆菌系统成功表达NiV N蛋白,Ni-NTA方法获得纯化蛋白,N蛋白免疫小鼠经杂交瘤融合技术筛选并纯化得到3株单克隆抗体。3、抗体配对后建立了双抗体夹心ELISA方法和免疫层析分析方法用于快速检测NiV抗原,灵敏度和特异性均较好。
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