目前子宫内膜癌呈逐年上升趋势,且有年轻化趋势。临床上绝大多数子宫内膜癌是雌激素依赖型,一般认为无孕激素对抗的长期雌激素刺激在子宫内膜癌发生中起重要作用。雌激素通过激活雌激素受体(estrogen receptor,ER)转录调控下游的信号分子,诱导子宫内膜癌的发生。流行病学研究显示炎症在子宫内膜癌发生中具有重要作用。炎性体激活是机体发生炎症反应的中心环节,其持续表达可导致慢性炎性疾病,最终导致恶性肿瘤发生。雌激素可通过ER调控炎性体表达参与机体多种疾病的发生。在本研究中,我们通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、定量PCR和Western blotting研究了正常子宫内膜与子宫内膜癌中各种炎性体的表达;研究了 NLRP3炎性体对子宫内膜癌细胞的表达变化对子宫内膜癌细胞生物学行为影响;研究了雌激素对NLRP3炎性体的调控作用;探讨了 NLRP3促进子宫内膜癌发生的下游信号通路;最后通过体内实验验证了 NLRP3对子宫内膜癌肿瘤生长的影响。第一部分炎性小体在人子宫内膜癌组织中的表达目的:研究不同亚型炎性小体及活化产物在人正常子宫内膜及子宫内膜癌组织中的表达情况。方法:选取武汉协和医院经病理诊断证实的12例子宫内膜癌手术切除标本和门诊24例阴道流血经病理诊断为良性、未提示子宫内膜炎的患者,及武汉协和医院组织样本库保存的子宫内膜癌石蜡切块19例(平均年龄41.3±2.579岁)行IHC检测。另外取液氮冻存的子宫内膜癌手术切除标本及癌旁正常组织共15例行qRT-PCR检测,包括 NLRP3、NLRC4、NLRP7、AIM2、ASC、caspasel、IL-1β、IL-18 的表达。最后行Western blotting检测NLRP3的表达。结果:IHC与qRT-PCR检测NLRC4与NLRP7在正常子宫内膜与内膜癌组织中表达无明显差异。IHC、qRT-PCR与Western blotting检测NLRP3在子宫内膜癌中表达高于正常子宫内膜(均P<0.05)。IHC显示AIM2在正常子宫内膜与内膜癌组织中表达阳性率均较高,两者差异无显著性,但qRT-PCR显示AIM2在子宫内膜癌中表达高于正常内膜,两者比较具有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR检测ASC、caspasel、IL-1β在子宫内膜癌中表达升高,差异具有显著性,IL-18在子宫内膜癌组织中表达与正常内膜无明显差异。NLRP3表达与临床分期及病理分级相关,分期及分级越高,NLRP3表达量越高。结论:NLRP3在子宫内膜癌中高表达,炎性体组分与激活物在子宫内膜癌中高表达。NLRP3可能通过组装成炎性小体在子宫内膜癌中发挥作用。NLRP3表达与临床分期及病理分期呈正相关。第二部分NLRP3炎性小体表达失调对子宫内膜癌细胞恶性生物学行为的影响目的:研究NLRP3炎性小体对子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为影响。方法:通过转染shRNA质粒和慢病毒过表达载体构建稳定敲除或过表达NLRP3的子宫内膜癌细胞株,通过Western blotting、qRT-PCR检测抑制或过表达NLRP3效果。采用CCK8法、划痕实验、克隆形成、Transwell实验评估抑制或过表达NLRP3后子宫内膜癌细胞侵袭、转移及增殖能力变化。Western blotting检测抑制或过表达NLRP3后细胞内炎性体组分及其激活物的表达变化。NLRP3激活物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激Ishikawa细胞后检测细胞增殖作用。结果:下调子宫内膜癌细胞Ishikawa和HEC-1A细胞内NLRP3表达后,细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均明显下降。NLRP3下调后同时伴有caspase-1、IL-1β表达水平下降,而IL-18水平无明显变化。上调NLRP3表达后,Ishikawa细胞与HEC-1A细胞增殖及侵袭、迁移能力增强。LPS可刺激Ishikawa细胞内NLRP3表达,并可促进细胞增殖。结论:NLRP3促进子宫内膜癌细胞的恶性生物学行为,下调NLRP3可抑制子宫内膜癌细胞的增殖效应。NLRP3表达水平的变化伴随其效应分子caspasel与IL-1β改变。因此,调控NLRP3炎性小体的表达和功能可能是预防和治疗子宫内膜癌的有效策略。第三部分雌激素介导NLRP3通过IL-1β/PI3K/AKT信号通路调控子宫内膜癌发生的分子机制研究目的:1.研究雌激素受体(ER)对NLRP3炎性体的调控作用。2.探讨子宫内膜癌中NLRP3炎性体下游的信号通路。方法:雌激素刺激Ishikawa细胞后观察NLRP3炎性体的活化;抑制ERα与ERβ后观察炎性体的活化;下调NLRP3后给予Ishikawa细胞雌激素刺激,观察NLRP3对雌激素诱导的细胞增殖效应影响;Ishikawa细胞过表达NLRP3后,给予ERβ抑制剂,观察ERβ对NLRP3促细胞增殖的调控作用;上调或下调NLRP3后检测AKT信号通路;用炎性体特异性抑制剂YVAD-cmk抑制炎性体表达后检测信号通路变化。结果:雌激素刺激Ishikawa细胞24h后,细胞内NLRP3、IL-1β表达升高。抑制Ishikawa细胞内ERα后,NLRP3表达水平无明显变化,而抑制细胞内ERβ后,NLRP3与IL-1iβ表达下降。下调Ishikawa细胞内NLRP3后给予雌激素刺激,细胞增殖能力较阴性对照组降低,差异具有显著性。ERβ特异性抑制剂PHTPP可部分抑制NLRP3的这种促细胞增殖作用。Ishikawa细胞上调NLRP3后PI3K/AKT磷酸化水平增加,BCL-2表达增加。下调NLRP3后,PI3K/AKT磷酸化水平减少。PHTPP与炎性体抑制剂YVAD-cmk处理Ishikawa后,再给予雌激素刺激,AKT及磷酸化水平减少。结论:子宫内膜癌中雌激素可调控NLRP3炎性小体表达,且这种作用是通过ERβ实现的。雌激素通过NLRP3炎性体介导调控IL-1β/PI3K/AKT通路在子宫内膜癌发生中发挥作用。第四部分NLRP3表达对子宫内膜癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:研究体内条件下NLRP3表达水平改变对子宫内膜癌瘤体生长的影响。方法:实验动物选用周龄4～6周的雌性BALB/c-nude裸鼠,在无菌SPF级环境中饲养。12只裸鼠随机分为两组,每组6只,对照组注射转染空白载体的Ishikawa细胞,实验组注射稳定转染shNLRP3质粒的Ishikawa细胞,建立裸鼠移植瘤模型。接种细胞后,每5天用游标卡尺测量瘤结节的长径和短径一次,并计算肿瘤体积,计算公式为V=a×b2×0.5236(a为长径,b为短径)。连续饲养40天后脱臼处死,剥离肿瘤称重。取下的瘤体用免疫组织化学法与Western blotting方法检测相关蛋白的表达。结果:观察过程中对照组裸鼠成瘤5只,其中1只因恶病质死亡。实验组成瘤4只。与对照组比较,沉默NLRP3表达后,移植瘤生长缓慢,体积和重量变小。Western blotting 结果显示实验组 caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、AKT、p-AKT、Ki67、VEGF蛋白表达量均较对照组下降。结论:沉默NLRP3后,子宫内膜癌成瘤能力降低。