目的:分化和衰老是多细胞真核生物的主要功能特点,存在大量非编码序列(non-protein coding DNA)和重复序列是多细胞真核生物的基因组结构特征,这些功能特点和结构特征之间可能存在某种内在联系。研究非编码序列调节基因表达的机理、寻找非编码序列新的生物学功能对于认识分化和衰老的过程会有重要帮助。　　 非编码序列的DNA结构在基因表达调节中起重要作用,B淋巴细胞的VDJ重组需要回文序列,回文序列涉及病毒转录、复制等多种生物学过程。生物信息学分析发现在小片段水平(字符串),人基因组DNA单链也存在互补性,说明回文序列(可以形成茎-环结构)在DNA中广泛存在。我们在实验研究中发现SV40PolyA中有一段17bp序列(5AAAAAAATGCTTTATTT)插入GFP基因下游可以活化基因并且有茎-环结构,本论文要证明这种结构在基因表达调节中所起的作用,是否这是非编码序列的一项新的生物学功能。为了叙述方便,我们将这种茎-环结构命名为微小茎-环(micro stem-loop),用于指称可以活化基因的具有3bp的环和3bp的茎的DNA序列。　　 方法:1合成引物和作为模板的DNA片段委托DNA合成公司合成带适当酶切位点的引物,合成带有不同突变位点或突变部位的DNA片段作为模板。Tablel为本论文所使用的人工合成寡核苷酸序列及其名称。　　 2表达载体构建用带有合适酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,目的片段包括质粒中的DNA序列和合成的DNA片段,酶切后插入pEGFP-C1质粒,获得插有一个片段的表达载体,利用XbaⅠ/NheⅠ酶切位点可以用T4 DNA连接酶连接,但是连接以后的位点不能被其中的任何一个酶切断的特性制备同向二串连体。本论文所用表达载体见Table2。　　 3细胞转染和荧光观察将表达载体用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。　　 4 Northern杂交用9N随机引物和大肠杆菌DNA聚合酶大片段,将α-32p-dCTP掺入DNA中制备GFP探针。提取转染细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,将RNA转移到尼龙膜。32p标记的GFP探针杂交、冲洗后通过放射自显影记录实验结果。然后,这种杂交过的尼龙膜用剥离液处理,去除32p-GFP探针,用检测neo RNA的探针再次杂交,放射自显影作为转染效率的对照。　　 结果:　　 1重组质粒鉴定　　 构建质粒经核酸内切酶酶切分析,PCR分析初步判断重组质粒中所插入的片段与预期长度一致,最后经过测序证实。Table3和Fig.1为本实验使用表达载体的测序结果,全部正确无误。　　 2删减2F2R对活化基因的影响　　 本文中所要研究的序列来自SV40PolyA反序(240bp),将SV40PolyA反序分成60bp一段,分别称为1F1R,2F2R,3F3R和4F4R,其位置和序列见Fig.2A。2F2R.插入pAlul4的GFP和Alu序列之间可以解除Alul4对GFP基因表达的抑制作用。为了获得2F2R中的何种序列可以活化基因的证据,本文中对2F2R进行删减分析(Fig.2B)。　　 3删减2F2R3端碱基对活化基因的影响　　 Fig.3为2F2R.3端删减碱基后,单体或二串连体插入。pAlul4质粒GFP基因下游,转染细胞后Northern检测结果。可见单体和二串联体随着删减碱基的增加,活化基因作用下降,19R和16R活化基因作用很弱。2F2R及其删减序列二串联体的活化基因作用均高于其相应的单体。碱基删减和串联还影响转录终止位置,单个45R的低分子转录物和高分子转录物各占约1/2,但是二聚体45R以低分子量转录物为主(这可能是因为串联使终止位点的作用加强),双体19R明显出现低分子量的转录物,与其单体表现不同。30R与22R单体和双体均以高分子量转录物为主。　　 Fig.4是2F2R的其他两个位置的序列Poly4和Secloop的单体(Fig.2B)和二串联体插入pAlul4质粒的Northern检测结果。该两个片段插入质粒与pAlul4比较均没有活化基因作用。　　 Fig.5是17ntAT与22R的区别在于删除了上游的"5-GTG"和下游的"GT-3",17ntAT缺失了22R上游的3个碱基和下游的2个碱基,仍然具有活化基因的作用,且转录物的量不低于22R,说明这删除的5个碱基对于活化基因并不重要。19R删除了下游的3个碱基("TGT-3"),转录量明显下降,说明从22R下游数第三个碱基(T)对于转录至关重要。在19R的基础上再删除下游的3个碱基(ATT-3)成为16R,转录量又进一步下降。与其他序列相同,17ntAT二串联体的转录量高于单体。22R上游和下游的5个碱基尽管对转录量不产生影响,但是明显促进转录延伸,与17ntAT比较,22R产生高分子量的转录物。　　 430R与Poly4串连增加活化基因作用　　 30R与Poly4串联有协同活化基因的作用(Fig.6A,Lanel-6)与Alul4(Lane5)比较,30R可以活化基因(Lanel),Poly4不能活化基因(Lane2)。30R的下游连接Poly4活化基因作用高过30R(Lane3,4),说明Poly4可以加强30R的作用。30R-Poly4与2F2R相比,在中间加入酶切位点(15碱基,Fig.6B),由于这15个碱基的插入使高分子量转录物的量上升,使转录物的总量有所下降。　　 5两个22R之间连接碱基数对活化GFP基因的作用　　 我们使甩22R即"5GTGAAAAAAATGCTTFATTTGT"来研究17bp序列,因为酶切位点的碱基组成也会对17bp序列的作用产生影响。上游有"GTG",下游有"GT"在一定程度上可以隔离酶切位点的影响。改变两个22R之间的碱基数观察对GFP基因的活化作用,碱基序列如Fig.7B,两个22R之间的碱基数对活化基因作用没有明显的影响(Fig.7A),该特性不同于2F2R和30R-Poly4串联体的比较(0碱基连接活化基因作用高于15碱基连接)。中间有两个碱基(Fig.7A,Lane3)和15个碱基(Fig.7A,Lane9)导致明显的高分子量转录物出现。　　 6改变loop碱基类型和loop的碱基数对活化GFP基因的作用　　 改变22R中loop的碱基类型和长度,然后插入pAlul4质粒,转染细胞后Northern检测对GFP基因表达的影响。改变的碱基序列见Fig.8B,GFP探针杂交结果见Fig.8A.Loop为TGC(22R*2,野生型)活化基因作用最强,其次是GTC和TCC;GCA活化基因作用较弱。Loop从0碱基到6碱基比较,以3碱基(22R*2,野生型)活化基因作用最强,loop碱基数过多或过少活化基因作用减弱。值得注意的是在不同loop碱基数的7个质粒中,只有TGC(22R,野生型)产生高分子量转录产物;与碱基类型改变的5个质粒比较,也只有TGC(22R,野生型)产生最多的高分子转录产物。　　 7茎-环结构与活化基因有关　　 17bp序列突变为5AAAAAAATGCTTTTTTT(4T),等于去掉了两个茎中间的泡,使茎的互补更加牢固,则失去活化基因作用(Fig.9A,Lane2),而如果同时突变"AAAAAAA",即形成5AAATAAATGCTTTTTTT(使泡恢复)则恢复活化基因作用(Fig.9A,Lanel);5AAAAAAATGCAAAAAAA和5TTTTTTTTTGCTTTTTTTT这种没有互补的类似序列没有活化基因的作用(Fig.9,Lane4,5)。　　 结论:　　 1碱基删减发现2F2R60bp序列中17bp序列是活化基因的核心序列。　　 2 Poly4虽然不能活化基因但是可以加强30R的基因活化作用。　　 345R,30R,22R二串联体的活化基因作用高于其单体。　　 4串连体的连接碱基数对基因活化产生影响。　　 517bp核心序列的lOOp碱基类型和碱基数以野生型活化基因作用最强,分别为"TGC"和3碱基。　　 617bp序列结构影响基因表达,过多互补和过少互补均不利于活化基因。　　 717bp序列茎的长度也影响基因表达,过长或过短都不利于基因表达,以野生型茎为3碱基活化基因作用最强。