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酿酒酵母是大规模酒精工业生产用菌种,工业酵母菌株具有高抗逆性、高产醇等优势;然而工业菌株蛋白表达能力有限,限制其作为生物医药产品和酶制剂生产平台的应用。本工作以木质纤维素酶解和利用中最重要的组分之一β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）为目的蛋白,研究蛋白质分泌途径关键基因修饰对外源蛋白表达的作用,为实现β-葡萄糖苷酶高水平、高锚定或分泌表达奠定基础。为此,选择酵母蛋白质分泌途径五个关键基因进行失活或过表达修饰,考察对β-葡萄糖苷酶锚定或分泌表达的影响。具体如下:一、单基因修饰对β-葡萄糖苷酶表达的影响1、基因YPS1和YPS2失活对比分析已构建菌株AαL（yps1）（BG）、AαL（yps2）（BG）和对照菌株AαL（BG）的发酵上清液蛋白质浓度和SDS-PAGE带型,结果显示蛋白质带型发生明显变化,初步证明β-葡萄糖苷酶分泌表达确实存在降解,基因YPS1和YPS2失活使其表达量明显上升。2、ERV25、PDI1、KAR2基因过表达利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了过表达菌株AαL（ERV25）、AαL（PDI1）、AαL（KAR2）;分别导入锚定表达质粒BG-cwp和分泌表达质粒BG,对所得菌株和对照菌株进行了YPC中的生长、酶活和发酵评价。结果显示:1)生长和耗糖:ERV25过表达促进了相应菌株利用纤维二糖的生长、耗糖速度,菌株AαL（ERV25）（BG-cwp）和AαL（ERV25）（BG）分别在36-48 h内、24 h左右耗光纤维二糖,较其它菌株更早些进入稳定期;2)产醇:三个基因过表达提高了所有菌株利用纤维二糖的最大乙醇浓度,并以ERV25过表达菌株产醇浓度最高,AαL（ERV25）（BG-cwp）和AαL（ERV25）（BG）的最大值分别为7.797 g/L和8.669 g/L,而相应对照菌株值为5.698 g/L和5.998 g/L;3)酶活:内源基因修饰不同程度提高了表达最大酶活,锚定型菌株和分泌型菌株分别在72 h和48 h得到最大值;在锚定比例基本不变或略有下降的同时,分泌型表达的分泌比例上升显著,增幅22%到36%;4)UPR响应:以β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR响应值与β-葡萄糖苷酶酶活水平呈现正相关性。综上分析,三个基因过表达修饰均能有效促进酵母菌株表达β-葡萄糖苷酶,效应从大到小顺次为ERV25、KAR2、PDI1。二、双基因修饰对β-葡萄糖苷酶表达的影响同法构建了五个双基因修饰菌株AαL（ERV25/yps1）、AαL（yps1/yps2）、AαL（KAR2/PDI1）、AαL（PDI1/yps1）、AαL（KAR2/yps1）,分别导入质粒BG-cwp和BG,对所得菌株和对照菌株进行了YPC中的生长、酶活和发酵评价。结果显示:1)生长和耗糖:所有菌株84 h左右进入稳定期、36-48 h内耗光纤维二糖;其中ERV25/yps1修饰菌株和yps1/yps2修饰菌株表现出了更为明显些的生长优势;2)酶活:除AαL（PDI1/yps1）（BG-cwp）酶活值较相应对照菌株低(最大值仅0.0703 U/m L/OD600)外,所有菌株酶活均高于对照菌株;总体上分泌型表达酶活值都高于相应锚定型表达酶活值;分泌表达菌株中,AαL（ERV25/yps1）（BG）和AαL（yps1/yps2）（BG）拥有更高的酶活值,48 h分别达到0.5460 U/m L/OD600和0.4746 U/m L/OD600,是对照菌株相应值的3.37倍和2.67倍;锚定型表达菌株中,AαL（yps1/yps2）（BG-cwp）表达水平最高,最大酶活值为0.2158 U/m L/OD600（48 h）;除yps1/yps2双失活菌株中锚定型表达锚定比例完全不受影响外,其余所有双基因修饰都降低了锚定型表达的锚定比例;而分泌型表达菌株则分泌比例全部有不同程度的上升,AαL（ERV25/yps1）（BG）的最高分泌比例是对照菌株相应值的1.61倍。综上分析,双基因修饰组合以ERV25/yps1和yps1/yps2促进酵母表达效果最好,而PDI1/yps1则不利于锚定表达。三、质粒稳定性评价对比评价了三个质粒YCplac33、YEplac195和YEplac195-Aa BGL（简称BG）在两个宿主AαL和AαL（yps1/yps2）中的稳定性。结果证明YPS1/YPS2双内源基因失活修饰显著提高了质粒稳定性,而β-葡萄糖苷酶的表达则显著降低了质粒稳定性。上述研究将有利于改善酵母蛋白生产能力,推动对工业酵母蛋白质分泌途径及其调控规律的了解,从而更好地开发利用此重要工业微生物。