一、背景和目的目前构建心脏生物起搏细胞主要有两种策略:以基因为基础和以细胞为基础。前一种方法根据窦房结（SAN）细胞特异的离子通道和对胚胎SAN发育起关键作用的转录因子,采用单个基因或者多基因组合进行转染干预。过表达超级化激活环核苷酸门控（HCN）通道,产生对自主神经调节敏感的起搏电流（If）是以基因为基础的构建生物起搏点的策略之一,这种类型的通道产生的内向电流主要在舒张期,从而避免了对动作电位的干扰。T盒基因（Tbx）家族是心肌细胞形成和分化的主要调控因子,如Tbx3,Tbx5和Tbx18在胚胎SAN发育中起关键作用,而这些因子的上游是Tbx18,已有研究显示单用Tbx18转录因子即可将静止心肌诱导成心脏起搏样细胞并显示出该因子在构建心脏生物起搏器方面广阔的应用前景。后一种以细胞为基础构建的方法包括两个方面:直接将细胞转化为SAN样起搏细胞和将细胞作为基因的运输载体。骨髓间充质干细胞（MSCs）是心脏生物起搏器理想的干细胞来源,具有免疫豁免优势和相对电静止特性。且能够很容易通过缝隙连接与相邻的细胞进行偶联。MSCs具有直接分化为心肌细胞的能力,但这种能力非常弱。c-kit是心脏前体细胞的标记,在MSCs也有表达,犬MSCs（cMSCs）和心肌细胞一样都来自早期中胚层,不同的分化调控因子决定了其各自不同的分化方向。本实验将SAN发育过程中重要的调控因子Tbx18在c-kit+cMSCs过表达,研究是否能介导c-kit+cMSCs向SAN细胞分化,从而具有天然SAN细胞相似的表观特征。同时研究Tbx18转染的c-kit+cMSCs在与犬心房肌共培养的环境中能否与其形成偶联,从而构成功能性的合胞体。心脏的电偶联由缝隙链接介导,缝隙连接蛋白（connexin,Cx）组成的跨膜通道聚合体构成了细胞间的缝隙链接。不同的聚合体由于排列方式的不同分为同聚体同侧型、同聚体异侧型、异聚体同侧型和异聚体异侧型四类。通过允许小分子和离子沿其电化学梯度扩散,缝隙链接为电冲动的扩步提供了低电阻路径。目前在人类发现的Cx有21种,它们各自具有不同的生物物理学性质,包括电导、电压、PH、对离子和小分子（荧光染料）的选择性通透。细胞间的偶联由Cx的数量和Cx所构成通道的活性所决定,这些都受到上游转录调控因子的严格管控。目前在心脏发现有4种Cx表达:connexin43（Cx43）,Cx40,Cx45和Cx37。这些Cx在心脏不同区域表达目的是传递不同的被动电学特性,其中Cx45主要在哺乳动物SAN细胞表达,是对缝隙链接处电压变化最敏感的Cx,当其细胞质相对于周围细胞电位偏负时,Cx45通道将关闭,这将有效防止周围心肌的除极电流返流入SAN细胞,干扰正常电冲动的传导顺序。以往的在体研究仅单纯用HCN4病毒载体转染MSCs,这种构建方式得到的生物起搏频率远远低于正常SAN的起博频率,本实验采用编码Cx45的缝隙连接蛋白α7（gap junction protein-alpha 7,GJA7）基因与HCN4基因两个慢病毒载体共转染cMSCs,研究是否能进一步促使单纯HCN4病毒载体转染cMSCs向SAN样细胞分化。将HCN2过表达的MSCs注射入房室传导阻滞犬的左心室游离壁可以获得满足生理需要的起搏频率和对儿茶酚胺药物的反应性,但该起搏功能在注射后8周即开始下降,由于没有发生排斥反应和细胞凋亡现象,考虑该原因是由于细胞从注射部位迁移。因此采用生物材料将细胞包裹固定是目前的研究热点,壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,其在37°℃能发生溶液-凝胶转变,具有较少的化学交联毒性。本实验选用壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶,将这种可注射生物材料包裹病毒转染的cMSCs,去评价这种生物高聚物能否作为细胞的输送载体为细胞的存活和固定提供适宜的基质环境,观察细胞在温敏水凝胶内的存活增殖情况,为下一步在体动物实验研究打下基础。研究方法:1.培养 cMSCs 和分选 c-kit+cMSCs。cMSCs首先从新生犬股骨和胫骨分离和培养。一部分正常培养传代,一部分用流式活细胞分选技术从P3代cMSCs中分选出c-kit+cMSCs,并进行细胞表面抗原鉴定（CD45/CD29/CD44）。2.构建hTbx18慢病毒载体转染c-kit+cMSCs;构建hHCN4和hGJA7慢病毒载体单独或者共同转染cMSCs。2.1 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>hTBX18[NM 001080508.2]:T2A:{EYFP}作为实验组,构建慢病毒载体 pLV[Exp]-Puro-EF1A>{EYFP}作为对照组。将已构建好的两组慢病毒载体分别转染c-kit+cMSCs获得Tbx18-EYFP-c-kit+c MSCs和EYFP-c-kit+cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybr ene的最适浓度。细胞转染4天后行RT-PCR实验验证hTbx18基因在Tbx18-EYFP-c-ki t+cMSCs中过表达。2.2 用 Gateway 方法构建慢病毒载体 pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>hHCN4[NM 005477.2]和 pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJC1[NM₀05497.3]作为实验组,构建pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-Null作为对照组。将构建好的慢病毒载体分别转染cMSCs得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和GFP-cMSCs,转染前行预实验确定慢病毒转染的最佳感染复数、polybrene的最适浓度。在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs首先通过2μg/mL的嘌呤霉素纯化5天,再加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1A>hGJ C1进行共转染。以上步骤共构建成功:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs及其对照组EYFP-c-kit+cMSCs;HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 和 HCN4+GJA7-cMS Cs共转染组。3.进行犬SAN和犬心房肌细胞原代分离培养及体外共培养环境。犬SAN原代细胞被分离后制备成悬浮细胞,新鲜分离的细胞作为阳性对照组,6小时内用于后续实验。犬心房肌从新生犬右心房分离,采用差速贴壁及5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）方法纯化培养细胞。原代心房肌细胞培养24小时后,以4:1的比例（80%心房肌细胞）分别与上述转染细胞混合进行共培养。4.各组细胞的功能检测。4.1 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs在转染后4天分别收集进行SAN特异型特征的检测,并于新生犬SAN细胞进行对比;Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后进行细胞膜片钳检测各组If电流生成情况,用Lucifer荧光黄染料进行细胞间缝隙连接评价,并于新生犬SAN细胞进行对比。4.1.1细胞内环磷酸腺苷[1]分析:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs细胞内 cAMP水平。4.1.2 RT-qPCR:检测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中Cx45,Kir2.1,PLB 和α-actinin相对mRNA表达水平。4.1.3 WB:监测犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs中HCN4,Cx45,PLB,p-PLB和α-actinin的蛋白表达水平。4.1.4 免疫荧光:检测Cx45在犬SAN细胞,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和EYFP-c-kit+cMSCs中的免疫荧光显像。4.1.5共培养环境下转染细胞的电生理检测:采用全细胞膜片钳和穿孔全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案记录特征性的If电流,评价该通道的激活和失活特性,测试其对异丙肾上腺素药物刺激的反应,染料转移实验评价缝隙连接情况。4.2 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs分别与新生犬心房肌细胞共培养三天后,加入2μgmL的嘌呤霉素连续五天以清除心房肌细胞,收集各组细胞行SAN细胞特异性指标检测和细胞膜片钳检测If电流生成情况。4.2.1 RT-qPCR:检测 HCN4-GFP-cMSCs,GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs和HCN4+GJA7-cMSCs中Cx45,Cx43,Tbx3,Tbx18和编码同源异型盒蛋白Nkx-2.5的基因（Nkx2.5）相对mRNA表达水平。4.2.2细胞膜片钳检测:采用全细胞膜片钳技术,应用激活和失活电压钳制方案对比各组记录到的特征性的If电流。5.转染细胞与温敏水凝胶共培养及功能检测。5.1浸提实验和CCK-8检测:用来评价温敏水凝胶材料的细胞毒性。以不含细胞的纯培养基为空白对照组,以培养基中含有0.64%萘酚为阳性对照组,以不含浸提液的纯培养基为阴性对照组,每组均设6个复孔。5.2 CCK-8检测转染细胞胶内增殖情况:Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别于转染后72小时和温敏水凝胶共培养,cMSCs,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSC,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组,每组均设6个复孔,CCK-8试剂于1天,4天,7天检测,观察胶内细胞增殖情况。5.3 激光共聚焦检测:观察 Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶材料共培养4天后凝胶内细胞形态。5.4 iCelligence实时检测:评价Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs 在凝胶内实时生长情况,cMSCs,Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs作为对照组。结果:1.流式活细胞分选将c-kit+细胞分选出来,分选后分析显示c-kit+细胞纯度大于90%,死细胞数小于10%,细胞表面抗原鉴定显示CD29+,CD44+,CD45-。2.pLV-hTbx18-EYFP或pLV-EYFP使用5μg/mL polybrene,以MOI=100的浓度分别转染c-kit+cMSCs 24小时得到Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和EYFP-c-kit+cMSCs。病毒转染后48小时,转染的c-kit+cMSCs展现黄色荧光,6个不同随机视野下激光共聚焦显微镜分析pLV-hTbx18-EYFP的转染效率为94±3.5%,pLV-EYFP-cMSCs的转染效率为96±2.5%。RT-PCR显示基于人Tbx1 8设计的引物可以在Tbx1 8-EYFP-c-kit+cMSCs中检测到Tbx1 8的表达。使用6μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度转染24小时得到HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs,GFP-cMSCs,病毒转染后72小时,转染的cMSCs分别展现绿色,红色和绿色荧光,6个不同随机视野下荧光显微镜分析三组细胞的转染效率均大于90%,在共转染情况下,HCN4-GFP-cMSCs中加入pLV[Exp]-mCherry:T2A:Puro-EF1 A>hGJC1,用6 μg/mL polybrene,以MOI=50的浓度进行共转染,用2μg/mL嘌呤霉素纯化转染细胞5天,6个不同随机视野下荧光显微镜分析共转染细胞表达黄色荧光,转染效率大于95%。3.新鲜分离的犬原代SAN细胞以细条钩形居多,细胞出现不规则节律性搏动,新鲜分离的犬原代心房肌细胞培养24小时可见完全貼壁生长,呈长杆状。按照4（心房肌细胞）:1的比例将Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs或EYFP-c-kit+cMSCs或HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs或GFP-cMSCs或HCN4+GJA7-cMSCs与心房肌分别混合,3天后各组共培养细胞生长成单层细胞。4.Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs具有天然SAN细胞的关键特征。Tbx18-EYFP-c-kit+cMS Cs同SAN细胞一样具有高的细胞内cAMP水平（n=3）。Cx45,Kir2.1,PLB,α-actinin的相对mRNA表达水平在Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs是上调的。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs和SAN细胞的HCN4,Cx45,PLB,p-PLB,α-actinin蛋白表达水平相似,与EYFP-c-kit+c MSCs明显不同。其中HCN4和Cx45的蛋白水平在Tbx18-c-kit+cMSCs分别是EYFP-c-kit+cMSCs的12倍和5.6倍。Cx45免疫荧光显像示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相似SAN细胞有Cx 45 表达,而 EYFP-c-kit+cMSCs 未见 Cx45 表达。在与犬心房肌共培养三天后,If电流的特征被记录。通过构建回归模型发现Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs 和 SAN的If电流趋势极其相似（I=-89.368+82.306 V-19.975 V 2+0.868 V3,F=693.056,Sig.<0.01,R2=0.983 vs.I=-110.892+102.927 V-26.637 V2+1.204 V3,F=649.977,Sig.<0.01,R2=0.982）。If电流的激活曲线显示V1/2在Tbx 18-EYFP-c-kit+cMSC s和S AN细胞之间有明显差异（-82.5±4.6,n=22 vs.-77.2±6.3 mV,n=18;P<0.05）,但是斜率因子K没有达到统计学意义上的差异（-7.7±0.4,n=22 vs.-8.1±0.2 mV,n=18;P=0.573）。相比SAN细胞,Tbx18-c-kit+cMSCs 有更正的反转电位（-18.41±1.2 mV,n=12 vs.-23.19±1.6 mV,n=10;P<0.05）。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的激活时间常数在 660±27（-120mV）～1880±103（-80mV）毫秒,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs If电流的失活时间常数在 1000±99（-70mV）～210±19（-40mV）毫秒。给予3μmol/L异丙肾上腺素,If电流的激活时间（-120 mV）减少了26±2%（n=8）。V1/2朝向去极化方向移动了大约 6.1 mV（从-84.9±5.6到-78.8±4.8 mV,n=8;P<0.05）。染料注入细胞5分钟后,Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs相邻的两个心房肌细胞也出现荧光显影,而EYFP-c-kit+cMSCs周围没有心房肌细胞显影。SAN细胞周围有一个细胞显影。HCN4+GJA7-cMSCs 促进 HCN4-GFP-cMSCs 或 GJA7-RFP-cMSCs 向窦房结样细胞分化。RT-qPCR显示GJA7-RFP-cMSCs相较GFP-cMSCs上调Tbx3的表达（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5的表达下降（n=8;p<0.05）,HCN4和Tbx18表达水平两组细胞没有明显差异（n=8;p>0.05）。HCN4+GJA7-cMSCs 共转染组的HCN4,Cx45,Tbx3表达水平比HCN4-GFP-cMSCs或GJA7-RFP-cMSCs组高（n=8;p<0.05）同时Cx43,Nkx2.5表达水平比单纯转染组低（n=8;p<0.05）,Tbx18表达水平在共转染组与单纯转染组之间无明显差异（n=8;p>0.05）。在与犬心房肌共培养三天后,全细胞膜片钳记录If电流的特征。GFP-cMSCs与GJA7-RFP-cMSCs均未记录到特征性的If电流HCN4+GJA7-cMSCs记录到的If 电流,其幅值增加（-1173.8±18.4 vs.-1057.9±14.6 mV,,与HCN4-GFP-cMSCs相比,n=3;p<0.05）,电流激活曲线右移,半数最大激活电压明显变正（-92.6±3.6 vs.-101.9±4.0 mV,n=3;P<0.05）,If通道的反转电位绝对值增加（-29.6±3.9 vs.-26.8±3.2 mV,n=3;p>0.05）。5.浸提实验第7天显示光密度（OD）值在12.5%,25%,50%,100%浸提液组分别为4.6247±0.099,4.5911±0.101,4.0057±0.087,4.5144±0.088,所有检测组的相对细胞增殖率均大于90%显示材料的细胞毒性在0～I级。CCK-8检测显示Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.6754±0.10501,4.3294±0.20432,3.7682±0.41215,HCN4-GFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在 1 天,4天,7天分别为3.2820±0.00686,4.4947±0.23174,4.3849±0.43016,GJA7-RFP-cMSCs与温敏水凝胶共培养组的OD值在1天,4天,7天分别为3.0181±0.31104,4.1634±0.26420,4.1348±0.36887,所有转染细胞在凝胶中存活4天达到增殖高峰,7天左右生长趋于平稳。Tbx18-EYFP-c-kit+cMSCs,HCN4-GFP-cMSCs,GJA7-RFP-cMSCs分别与温敏水凝胶共培养4天后于激光共聚焦显微镜下观察,可见黄色、绿色、红色荧光细胞在凝胶内不同层面分布生长。iCelligence检测示不同时间点温敏水凝胶内细胞的平均细胞指数未见明显变化。结论:1.Tbx18过表达c-kit+cMSCs介导其向SAN样细胞分化。2.HCN4+GJA7共转染cMSCs通过增强If电流的幅值,利于电信号的扩步促进HCN4-GFP-cMSCs向S AN样细胞分化。3.温敏水凝胶对生物起搏细胞的存活和生长提供了适宜的环境。