甘蓝型油菜天冬氨酸蛋白酶基因家族分析及BnAP29.C04调控自交不亲和的初步研究

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天冬氨酸蛋白酶(APs)属于一类重要的水解酶,在植物蛋白质加工、信号转导以及逆境响应具有重要的作用,但是对于甘蓝型油菜,尚无关于APs功能的报道。本研究从全基因组范围内鉴定到154个甘蓝型油菜BnAPs成员,并对其进行系统的生物信息学分析。本研究有利于提高对BnAPs的认识、发掘新的基因。同时在研究过程中发现BnAP29.C04在调控自交不亲和这一生物学过程中发挥功能,这既能够增进对自交不亲和机理的认识,也为利用该基因进行自交不亲和育种提供了可能。本研究主要得到的结果如下:(1)在甘蓝型油菜基因组中共鉴定到154个BnAPs基因,进一步将其进一步分为3类群,典型的、非典型以及类珠心,其中典型的有11个,非典型的135个,类珠心的8个。基因结构分析结果表明,多数BnAPs基因包含1~4个外显子。同一类型的BnAPs基因成员之间蛋白质基序分布相似。共线性分析表明,大约89%的BnAPs基因来自于全基因组复制事件,同时大约有88%的At APs对应有2个以上BnAPs同源基因,同源基因的Ka/Ks的比值均小于1,表明BnAPs在进化过程中经历了扩张以及选择。(2)与拟南芥同源基因的表达模式相比,大约有24%的BnAPs与其拟南芥同源基因具有相同的表达模式,27%的BnAPs与拟南芥的同源基因具有部分相同的表达模式,其余有49%的BnAPs与拟南芥的同源基因具有完全不同的表达模式。表明在进化过程中一部分BnAPs基因在维持原始同源基因功能的同时,其余基因可能经历了功能分化。(3)通过分析154个BnAPs基因启动子序列,发现其中包括大量与生长发育、激素以及逆境响应相关的调控元件。其中有56个BnAPs的启动子中包含与花发育相关的调控元件,分析转录组数据发现这些基因可能分别在花瓣、萼片、花丝、花粉以及花蕾组织生长中发挥重要作用,同时这些基因中有9个可能参与受精过程。同时有21个BnAPs包含激素及逆境相关调控元件,随后的RT-PCR验证表明其不同程度参与到ABA以及逆境的响应过程。(4)由于BnAP29.C04在授粉后无论在转录水平还是蛋白水平均显著下调,猜测可能是一个自交不亲和因子,通过CRISPR/Cas9技术在野生型(Westar)中特异性敲除BnAP29.C04,结果表明该基因的突变可以部分打破自交不亲和。与野生型(Westar)相比,基因编辑材料中GLO1、PLD1以及EXO70A1呈现上调表达的趋势,说明BnAP29.C04可能主要通过影响亲和基因的表达来影响自交不亲和。
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