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心力衰竭简称心衰,发病率和死亡率居于全球首位,严重威胁人类健康。心衰主要的病理生理学过程包括心室重构和心肌纤维化。近年来,尽管心衰药物治疗方面进展显著,临床上仍然缺乏治疗心肌纤维化的特效药。CRLs（Cullin-RING ligases）是最大的E3泛素连接酶家族,调控了哺乳动物细胞内约20%蛋白的动态平衡,其活性依赖于cullin的neddylation。Neddylation作为一种类泛素化修饰方式,通过E1-E2-E3酶介导来完成对底物的修饰,其最主要的底物是cullins。靶向neddylation已经成为一个重要的疾病治疗策略,尤其E1抑制剂MLN4924和TAS4464目前已处于临床阶段用于癌症治疗。最近,neddylation修饰在心血管和纤维化疾病中的关键作用逐渐被披露,然而靶向neddylation或该通路中关键蛋白在心肌纤维化方面的作用仍然未知。DCN1（Defective in cullin neddylation1）是neddylation通路中一个重要的co-E3连接酶,靶向DCN1可选择性抑制cullin neddylation,对探索单个CRL的生物学功能意义重大。然而,DCN1抑制剂的开发极具挑战性,目前此类抑制剂的结构类型尚不丰富,活性、选择性以及药代动力学性质有待改善。此外,DCN1抑制剂对除了癌症和肝损伤之外其它疾病的潜在治疗作用鲜有报道。因此,仍需开发高效、高选择性、低毒性和具有类药性质的新型小分子靶向抑制DCN1,以期丰富该类抑制剂的结构类型,探索其潜在的生物学功能。本课题运用理性的药物设计策略,共设计合成了两个系列新型DCN1抑制剂,并进行了抗心肌纤维化体内外活性评价。第一部分:新型2-硫代嘧啶类DCN1抑制剂的发现和抗心肌纤维化活性评价（1）针对本课题组2019年报道的DCN1抑制剂DC-2的对接模式和构效关系结果,综合运用基于结构的药物设计、生物电子等排等策略,展开进一步的结构优化和系统的构效关系探索,共合成了77个新型2-硫代嘧啶类DCN1抑制剂,还通过NMR和MS进行了结构确证。（2）HTRF实验显示DCN1抑制活性小于20 n M的化合物有14个,与阳性对照DC-2(IC50=18.31±1.12 n M)和COV(IC50=58.21±0.60 n M)比较表现出相当或更强的DCN1抑制作用。特别是化合物76(IC50=9.55±0.98 n M)具有比阳性对照DC-2更优的DCN1抑制活性、对DCN家族蛋白更高的选择性以及对心肌成纤维细胞（CFs）更低的毒性。分子对接、生物膜层干涉、NEDD8E1激活酶（NAE）和免疫共沉淀等实验证实化合物76可以特异性地靶向DCN1并抑制细胞内DCN1和UBC12间的相互作用。（3）基于测定活化的CFs中DCN1 m RNA和蛋白水平的表达量以及结合前期文献报道,我们推测DCN1可能参与了CFs活化过程。于是,我们尝试探索了DCN1抑制剂76在心肌纤维化方面的潜在作用和机制,结果显示:化合物76可有效抑制AngⅡ诱导的CFs异常增殖和迁移;此外,化合物76处理或敲低DCN1能有效缓解AngⅡ诱导的CFs激活,这种作用与抑制DCN1活性后所引起的cullin3 neddylation抑制以及其底物Nrf2和NQO1蓄积,进而增强CFs的抗氧化应激作用有关。小结:本项研究鉴定了一个高效、高选择性和低毒性的2-硫代嘧啶类DCN1抑制剂76,同时发现该抑制剂能够有效缓解AngⅡ诱导的CFs激活,揭示了靶向DCN1在心肌纤维化治疗方面的潜在作用。第二部分:新型3-巯基-1,2,4-三氮唑类DCN1抑制剂的发现和抗心肌纤维化活性评价（1）基于高通量虚拟筛选得到的苗头化合物HD1,运用基于结构的药物设计和生物电子等排等策略,进行结构修饰和构效关系探索,最终合成了67个新型3-巯基-1,2,4-三氮唑类DCN1抑制剂并使用NMR和MS进行了结构表征。（2）HTRF实验表明共有14个3-巯基-1,2,4-三氮唑衍生物的IC50值小于20n M。尤其,化合物HD2(IC50=2.96±0.80 n M)的DCN1抑制作用分别比阳性对照DC-2和COV高出约6倍和20倍。HD2还具有比阳性对照DC-2对DCN家族蛋白更高的选择性和对CFs更低的毒性。分子对接和分子动力学模拟实验显示HD2很好地占据了DCN1活性口袋并与DCN1形成了多个强效作用力。同时,细胞热迁移实验表明HD2可有效靶向细胞内的DCN1并增加其稳定性。（3）MTT和划痕实验揭示HD2有效抑制了AngⅡ诱导的CFs异常增殖和迁移。同时,HD2具有良好的药代动力学性质、类药性和体内安全性。此外,HD2能有效抑制AngⅡ引起的CFs活化以及缓解异丙肾上腺素（ISO）导致的心室重构和纤维化,此作用与靶向DCN1后所引起的cullin3 neddylation抑制和其下游Nrf2通路蓄积有关。小结:本项研究发现的3-巯基-1,2,4-三氮唑类衍生物HD2是一个高效、高选择性、低毒性和具有类药性质的DCN1抑制剂,在体内外都表现出良好的抗心肌纤维化作用。综上所述,本论文基于科学理性的药物设计策略,共合成了以2-硫代嘧啶和3-巯基-1,2,4-三氮唑为骨架的DCN1抑制剂144个,其中活性小于20 n M的化合物有28个,进一步丰富了DCN1抑制剂的结构类型;同时,优选DCN1抑制剂76和HD2可作为先导化合物进一步优化和开发。本课题还首次发现了靶向DCN1在治疗心肌纤维化方面的潜在作用,为开发DCN1抑制剂用于心脏疾病治疗提供了一定的理论依据和数据支撑。