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丁香酚(Eugenol)是月月粉(Rosa chinensis’Pallida’)重要的花香成分之一,具有浓郁的丁香气味。前人研究表明,丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferyl acetate)为底物,由丁香酚合成酶催化形成的。克隆分析月季丁香酚合成酶基因,不仅有利于明确丁香酚合成酶基因在花香调控中的作用,而且为利用转基因技术培育具有香味的月季品种提供候选基因。本文以古老月季品种月月粉为材料,利用RT-PCR结合RACE-PCR技术,克隆了月月粉RcEGS1基因,并运用实时荧光定量PCR法进行了该基因在不同组织部位和不同开放时期花瓣中的表达分析。将RcEGS1基因的完整编码框通过酶切、连接转到植物表达载体pBIA31中,构建了植物表达载体pBIA31-RcEGSl,采用农杆菌介导的叶盘法成功转化矮牵牛。本研究结果为进一步对RcEGSl进行功能验证和深入探讨月季苯基丙烯类物质代谢路径奠定基础。具体研究结果如下：1.利用GenBank发表的丁香酚合成酶基因的氨基酸保守序列设计引物,用同源克隆法和RACE-PCR技术,从中国古老月季月月粉盛开期的花瓣中获得了一个新的月季丁香酚合成酶基因,命名为RcEGS1, GenBank登录号为JQ522949。该基因全长为1171bp,开放阅读框(ORF)951bp,编码317个氨基酸,具有EGS基因的保守结构域KQVDVVIS和KⅡAAIK;其蛋白质理论分子量为35.64kD,等电点为7.36。氨基酸同源序列比较发现,月季RcEGS1与矮牵牛PhIGS1的氨基酸保守区同源性最高,具有70%同源性,与罗勒ObEGS1同源性达59%,与月季RhEGS1的同源性为48%。2.运用实时荧光定量PCR法对月月粉6个不同发育时期的花朵和4个不同组织部位进行分析,发现RcEGS1基因在花瓣、萼片中有表达,在叶片、茎段中没有表达,以花瓣中的表达量为最高,且在花蕾期没有表达,在盛开期的表达量最高,凋谢期表达量较低。即该基因的表达和月季花香物质释放量呈现一致的规律。3.用Smal、SaiI双酶切质粒pMD18-RcEGSl和表达载体pBIA31,将回收的全长基因片段和pBIA31大片段,用T4DNA连接酶连接,转化感受态细胞Trans5α对重组子菌液进行PCR扩增和双酶切鉴定,电泳获得预期约1000bp的条带,说明已成功构建了植物表达载体pBIA31-RcEGSl。4.将构建好的重组质粒转化根瘤农杆菌LBA4404感受态细胞,采用叶盘法转化无菌矮牵牛的幼嫩叶片。经过共培养和抗性筛选,提取再生植株的叶中DNA,进行PCR检测,初步证实得到7个阳性再生植株。