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本课题采用定点突变的方法，构建白念珠菌钙调蛋白基因定点突变cmdl表达质粒，转化入CMD1缺陷菌株，研究cmd1定点突变对重组菌株的生长周期及形态发生的影响，进一步从分子水平探讨白念珠菌钙调蛋白在致病机制中的作用。本课题分三部分：1、白念钙调蛋白基因缺陷重组菌株的构建和鉴定。先将含cmd1::TRP1置换序列的质粒Ⅰ转入酵母菌株YPH501，经省却Trp培养基和Southernblothing筛选出发生基因置换的重组菌株，其次将含URA3和CMD1表达序列的质粒Ⅱ转入，经省却Trp/Ura培养基筛选出阳性重组菌株，减数分裂后剖分四分体，经省却Trp/Ura培养基筛选出白念钙调蛋白基因缺陷TRP1单倍体菌株，再经基因置换成功构建了预期的白念钙调蛋白基因缺陷HIS3单倍体菌株。2、白念钙调蛋白定点突变重组菌株的构建和鉴定。设计使CMD1苯丙氨酸定点突变成丙氨酸的引物，采用两步PCR法进行单点和两点突变PCR扩增，并插入穿梭质粒Ⅳ（含TRP1序列）构建定点突变重组质粒，转入白念钙调蛋白缺陷HIS3单倍体，成功构建了白念钙调蛋白定点突变重组菌株。实验结果表明白念钙调蛋白F89+、F92+和F141+单点突变和F89+F141+两点突变均为非致死性突变，F89+F92+和F92+F141+两点突变为致死性突变。3、白念钙调蛋白定点突变对重组菌株的影响。将白念钙调蛋白定点突变单倍体菌株分别接种于省却Trp平板，置30℃、36℃、37℃和37.5℃恒温培养。采用流式细胞仪、光镜、电镜分析突变株的生长速度、形态和DNA合成周期。结果表明，当第92位苯丙氨酸定点突变成丙氨酸时重组菌株具有温度敏感性，再与89位或141位苯丙氨酸组成两点突变时引起重组菌株死亡，即致死性突变；而89位或141位苯丙氨酸单独定点突变成丙氨酸时，对重组菌株的形态、生长速度、DNA合成周期等没有影响（P＞0.05），也不形成温敏株；但89位和141位苯丙氨酸一起定点突变成丙氨酸时重组菌株也具有温敏性。两株温敏菌株的形态、生长速度和DNA合成周期与对照组相差显著－p州．DSL 因此，白念钙调蛋白C端球状＿结构中的三个苯丙氨酸尤其是第92位苯丙氨酸在维持白念珠菌钙调蛋白正常功能中具有重要地位。 在白念珠菌的双相转换中，菌丝相的出现是其处于致病状态的标志之一，白念钙调蛋白基因F92＋或F89＋F141＋定点突变后抑制了重组菌株形态的正常发生和DNA合成。因此，可以初步推断白念珠菌钙调蛋白C端球状结构中的三个苯丙氨酸尤其是第92位苯丙氨酸在白念珠菌的致病性中具有重要作用。