本文从以下几部分进行论述：　　第一章 TGF-β1及MMP-9在官腔粘连内膜组织中的表达与意义　　目的:　　检测IUA患者子宫内膜组织中TGF-β1以及MMP-9的表达情况，探讨TGF-β1和MMP-9与IUA发生发展的关系，初步研究IUA的形成机制，为后续试验提供前期理论依据和方向。　　方法:　　1.分组:　　选取2012年1月～2013年12月因“宫腔粘连”入我院妇科行TCRA手术治疗的患者共39例作为研究组，其中轻度粘连组9例，中度粘连组16例，重度粘连组14例，另设正常对照组13例（包括宫颈息肉5例，宫颈CINⅡ～Ⅲ级6例，子宫纵隔2例）。　　2.排除标准:　　①宫腔镜检查证实合并有其它子宫内疾病（如子宫粘膜下肌瘤、子宫内膜息肉、子宫内膜异位症等）;②有严重的内科系统疾病（凝血功能障碍、免疫系统疾病、严重心血管及肝、肾疾病、肿瘤）;③内分泌疾忠（功能失调性子宫出血、多囊卵巢综合征、甲状腺功能减退/亢进等）;④单纯宫颈粘连;⑤术后病理为分泌期子宫内膜。　　3.IHC法测定子宫内膜组织中TGF-β1及MMP-9的表达。　　所有患者均行TCRA术或宫腔镜检查术，并在宫腔镜镜下直接获取研究组及对照组患者的子宫内膜，4％多聚甲醛固定，经固定、脱水透明、浸蜡及包埋后制成组织蜡块并切片，切片厚度为4μm。组织切片常规脱蜡水化后，HE染色，选取增生期内膜组织切片，脱蜡水化，柠檬酸钠微波加热进行抗原修复，山羊血清封闭非特异性抗原，滴加一抗（兔抗人TGF-β1抗体或兔抗人MMP-9抗体）浓度1∶100，4℃过夜，孵育二抗，DAB显色，镜下观察，拍照留图。阳性的表达为背景中有突显的棕黄色或棕褐色颗粒，边界较清晰。阴性表达为无着色或与背景颜色一致，拍照留图。参考相关的免疫组化结果进行评分。　　结果：　　1.TGF-β1在各组患者子宫内膜组织中的表达　　对照组、轻度组、中度组、重度组TGF-β1在各组患者子宫内膜组织中的表达评分分别为:1.15±0.24、1.28±0.26、2.28±0.26、3.50±0.44。　　2.MMP-9在各组患者子宫内膜组织中的表达　　对照组、轻度组、中度组、重度组MMP-9在各组患者子宫内膜组织中的表达评分分别为:3.00±0.35、2.06±0.39、1.66±0.24、1.11±0.21。　　3.子宫内膜组织中TGF-β1与MMP-9表达的相关性　　将各组子宫内膜TGF-β1与MMP-9表达的积分进行Pearson相关分析后显示，TGF-β1与MMP-9的表达呈负相关（r=-0.821、P=0.000）。　　结论:　　1.IUA患者中度组及重度组的TGF-β1表达均高于对照组，且其表达随IUA分度的加重而递增。子宫内膜组织中TGF-β1的过高表达，提示对IUA的发生发展有促进作用。　　2.各组IUA患者MMP-9表达水平均低于对照组，其表达随IUA的分度加重而递减，提示MMP-9的低表达，促进了IUA发生发展。　　3.子宫内膜腺体细胞及基质细胞均可表达TGF-β1与MMP-9，两者的表达呈显著负相关，提示TGF-β1可能通过抑制MMP-9的表达参与IUA的形成。　　第二章 人子宫内膜基质细胞的分离纯化和体外培养方法研究　　目的:　　为进一步探讨人ESC上TGF-β1/Smad通路和MMP-9间的相互作用，分离和纯化人ESC并进行体外培养。　　方法:　　无菌条件下获取子宫内膜组织，放入含有DMEM-F12培养基的无菌平皿中，剪碎，先后用0.125％胰酶，0.8mg/ml的Ⅰ型胶原酶消化取细胞悬液，经400目筛网过滤一次后离心，120min细胞贴壁后换液，获得细胞进一步培养，约4d～6d后细胞长满瓶底＞80％传代，传至第3代，用免疫组化鉴定细胞，如为ESC，波形蛋白强阳性表达，而角蛋白呈阴性表达。观察结果留照。　　结果:　　1.分离消化获得的细胞在接种后约0.5h开始贴壁，可见梭形和多角两种形态的细胞，约2h细胞基本完成贴壁。　　2.细胞培养4d～6d后可传代，呈长梭形或纺锤形，胞体较小，具有成纤维细胞形态。传代至第3代，基质细胞中偶见上皮细胞团出现，基质细胞占比例＞95％，培养至第5代基本停止增殖。　　3.第三代传代细胞活性稳定，免疫组化细胞鉴定，显示波形蛋白免疫反应阳性，反应率可达95％以上，而角蛋白免疫反应性阴性，提示为ESC。分离出的ESC可以在体外进行增殖传代。　　结论:　　1.采用二次酶消化、一次滤网过滤和差时贴壁等方法，可成功地分离人ESC，细胞具有成纤维细胞特征，即波形蛋白阳性，角蛋白阴性。　　2.原代培养ESC可以稳定有限的传代，满足了进一步体外实验的需要。　　第三章 TGF-β1/smad通路调控体外人子宫内膜基质细胞表达MMP-9的研究　　目的:　　探讨TGF-β1/smad通路对人ESC的MMP-9表达的影响，进一步明确两者在IUA发生发展中的相互调节作用。　　方法:　　在人体ESC培养体系中加入浓度梯度的TGF-β1，浓度为0、0.1、1、2.5、5、10、20、50ng/ml，培养48h。　　1.WB法检测人ESC的Smad2、Smad3表达差异。　　2.ELISA法检测培养液中MMP-9的含量。　　结果:　　1.不同TGF-β1浓度刺激人ESC，48h后细胞Smad2、Smad3表达灰度水平　　随TGF-β1浓度的增加，Smad2蛋白表达水平无显著升高，无统计学意义(F=0.269、P=0.957)，Smad3表达水平升高，各浓度组之间有显著性差异，有统计学意义(F=22.564、P=0.000)。与对照组相比，除0.1 ng/ml处理组无显著差异(P=0.077)外，其余组与对照组均升高，有统计学意义，依次为(P=0.040、P=0.018、P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.000)其余大部分组间有差异(P＜0.05)，20与50ng/ml处理组间无差异(P=0.716)，表现为逐渐上升，最后维持在较高水平。　　2.不同TGF-β1浓度刺激人ESC，48h后培养液MMP-9的含量　　各浓度组有差异，具有统计学意义(F=191.246、P=0.000)。除0.1、1 ng/m处理组与对照组(P=1.000、P=0.089)，5与10ng/ml处理组(P=0.536)，20与50ng/ml处理组间无差异外(P=1.000)，其余各组组间有差异(P＜0.05)，MMP-9浓度表达逐渐下降，最后维持在较低水平。　　3.TGF-β1、Smad2、Smad3、MMP-9之间的相关性　　经Spearman相关分析结果显示，在人ESC中，浓度梯度TGF-β1刺激后，MMP-9表达与TGF-β1呈负相关（r=-0.950、P=0.000）。TGF-β1与smad3表达呈正相关(r=0.921、P=0.000)。TGF-β1与smad2表达无相关(r=0.139、P=0.516)。　　结论:　　1.人ESC体系中，TGF-β1刺激达一定浓度后，模拟细胞纤维化环境，ESC的Smad通路激活，Smad3表达升高，推测TGF-β1以Smad3蛋白通路为主，下传胞内信号。TGF-β1达20ng/ml时，细胞表达Smad3蛋白能力达饱和状态。　　2.人ESC体系中，TGF-β1刺激浓度不断升高，Smad2表达无改变，推测Smad2可能未参与TGF-β1细胞内信号通路的传导。　　3.人ESC体系中，TGF-β1刺激浓度不断升高，MMP-9表达逐渐下降，证实TGF-β1负调控ESC表达MMP-9，TGF-β1达20ng/ml后，MMP-9表达受抑制降至最低水平。　　4.MMP-9表达与TGF-β1呈负相关，TGF-β1与smad3表达呈正相关，TGF-β1与smad2表达无相关。推测TGF-β1可能主要通过Smad3通路下调MMP-9的表达，参与调节ECM代谢。　　5.在ESC上TGF-β1浓度达1ng/ml时，Smad3蛋白表达开始升高，浓度达2.5ng/ml时MMP-9表达开始下降，Smad3和MMP-9两者改变不同步，推测TGF-β1在ESC上另有下游调节通路存在，可能与Smad通路相互影响。　　小结：　　1.IUA患者子宫内膜腺体细胞及基质细胞均可表达TGF-β1与MMP-9。　　2.IUA患者子宫内膜组织表达TGF-β1和MMP-9水平呈显著负相关，TGF-β1可能通过负调控MMP-9参与IUA的形成。　　3.体外成功分离培养及传代子宫内膜基质细胞，具有稳定的成纤维细胞特性。　　4.人ESC处于纤维化环境时，TGF-β1以Smad3通路为主，下调MMP-9的表达，参与调节ECM代谢。