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本文从以下几部分进行论述: 第一章 TGF-β1及MMP-9在官腔粘连内膜组织中的表达与意义 目的: 检测IUA患者子宫内膜组织中TGF-β1以及MMP-9的表达情况,探讨TGF-β1和MMP-9与IUA发生发展的关系,初步研究IUA的形成机制,为后续试验提供前期理论依据和方向。 方法: 1.分组: 选取2012年1月~2013年12月因“宫腔粘连”入我院妇科行TCRA手术治疗的患者共39例作为研究组,其中轻度粘连组9例,中度粘连组16例,重度粘连组14例,另设正常对照组13例(包括宫颈息肉5例,宫颈CINⅡ~Ⅲ级6例,子宫纵隔2例)。 2.排除标准: ①宫腔镜检查证实合并有其它子宫内疾病(如子宫粘膜下肌瘤、子宫内膜息肉、子宫内膜异位症等);②有严重的内科系统疾病(凝血功能障碍、免疫系统疾病、严重心血管及肝、肾疾病、肿瘤);③内分泌疾忠(功能失调性子宫出血、多囊卵巢综合征、甲状腺功能减退/亢进等);④单纯宫颈粘连;⑤术后病理为分泌期子宫内膜。 3.IHC法测定子宫内膜组织中TGF-β1及MMP-9的表达。 所有患者均行TCRA术或宫腔镜检查术,并在宫腔镜镜下直接获取研究组及对照组患者的子宫内膜,4%多聚甲醛固定,经固定、脱水透明、浸蜡及包埋后制成组织蜡块并切片,切片厚度为4μm。组织切片常规脱蜡水化后,HE染色,选取增生期内膜组织切片,脱蜡水化,柠檬酸钠微波加热进行抗原修复,山羊血清封闭非特异性抗原,滴加一抗(兔抗人TGF-β1抗体或兔抗人MMP-9抗体)浓度1∶100,4℃过夜,孵育二抗,DAB显色,镜下观察,拍照留图。阳性的表达为背景中有突显的棕黄色或棕褐色颗粒,边界较清晰。阴性表达为无着色或与背景颜色一致,拍照留图。参考相关的免疫组化结果进行评分。 结果: 1.TGF-β1在各组患者子宫内膜组织中的表达 对照组、轻度组、中度组、重度组TGF-β1在各组患者子宫内膜组织中的表达评分分别为:1.15±0.24、1.28±0.26、2.28±0.26、3.50±0.44。 2.MMP-9在各组患者子宫内膜组织中的表达 对照组、轻度组、中度组、重度组MMP-9在各组患者子宫内膜组织中的表达评分分别为:3.00±0.35、2.06±0.39、1.66±0.24、1.11±0.21。 3.子宫内膜组织中TGF-β1与MMP-9表达的相关性 将各组子宫内膜TGF-β1与MMP-9表达的积分进行Pearson相关分析后显示,TGF-β1与MMP-9的表达呈负相关(r=-0.821、P=0.000)。 结论: 1.IUA患者中度组及重度组的TGF-β1表达均高于对照组,且其表达随IUA分度的加重而递增。子宫内膜组织中TGF-β1的过高表达,提示对IUA的发生发展有促进作用。 2.各组IUA患者MMP-9表达水平均低于对照组,其表达随IUA的分度加重而递减,提示MMP-9的低表达,促进了IUA发生发展。 3.子宫内膜腺体细胞及基质细胞均可表达TGF-β1与MMP-9,两者的表达呈显著负相关,提示TGF-β1可能通过抑制MMP-9的表达参与IUA的形成。 第二章 人子宫内膜基质细胞的分离纯化和体外培养方法研究 目的: 为进一步探讨人ESC上TGF-β1/Smad通路和MMP-9间的相互作用,分离和纯化人ESC并进行体外培养。 方法: 无菌条件下获取子宫内膜组织,放入含有DMEM-F12培养基的无菌平皿中,剪碎,先后用0.125%胰酶,0.8mg/ml的Ⅰ型胶原酶消化取细胞悬液,经400目筛网过滤一次后离心,120min细胞贴壁后换液,获得细胞进一步培养,约4d~6d后细胞长满瓶底>80%传代,传至第3代,用免疫组化鉴定细胞,如为ESC,波形蛋白强阳性表达,而角蛋白呈阴性表达。观察结果留照。 结果: 1.分离消化获得的细胞在接种后约0.5h开始贴壁,可见梭形和多角两种形态的细胞,约2h细胞基本完成贴壁。 2.细胞培养4d~6d后可传代,呈长梭形或纺锤形,胞体较小,具有成纤维细胞形态。传代至第3代,基质细胞中偶见上皮细胞团出现,基质细胞占比例>95%,培养至第5代基本停止增殖。 3.第三代传代细胞活性稳定,免疫组化细胞鉴定,显示波形蛋白免疫反应阳性,反应率可达95%以上,而角蛋白免疫反应性阴性,提示为ESC。分离出的ESC可以在体外进行增殖传代。 结论: 1.采用二次酶消化、一次滤网过滤和差时贴壁等方法,可成功地分离人ESC,细胞具有成纤维细胞特征,即波形蛋白阳性,角蛋白阴性。 2.原代培养ESC可以稳定有限的传代,满足了进一步体外实验的需要。 第三章 TGF-β1/smad通路调控体外人子宫内膜基质细胞表达MMP-9的研究 目的: 探讨TGF-β1/smad通路对人ESC的MMP-9表达的影响,进一步明确两者在IUA发生发展中的相互调节作用。 方法: 在人体ESC培养体系中加入浓度梯度的TGF-β1,浓度为0、0.1、1、2.5、5、10、20、50ng/ml,培养48h。 1.WB法检测人ESC的Smad2、Smad3表达差异。 2.ELISA法检测培养液中MMP-9的含量。 结果: 1.不同TGF-β1浓度刺激人ESC,48h后细胞Smad2、Smad3表达灰度水平 随TGF-β1浓度的增加,Smad2蛋白表达水平无显著升高,无统计学意义(F=0.269、P=0.957),Smad3表达水平升高,各浓度组之间有显著性差异,有统计学意义(F=22.564、P=0.000)。与对照组相比,除0.1 ng/ml处理组无显著差异(P=0.077)外,其余组与对照组均升高,有统计学意义,依次为(P=0.040、P=0.018、P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.000)其余大部分组间有差异(P<0.05),20与50ng/ml处理组间无差异(P=0.716),表现为逐渐上升,最后维持在较高水平。 2.不同TGF-β1浓度刺激人ESC,48h后培养液MMP-9的含量 各浓度组有差异,具有统计学意义(F=191.246、P=0.000)。除0.1、1 ng/m处理组与对照组(P=1.000、P=0.089),5与10ng/ml处理组(P=0.536),20与50ng/ml处理组间无差异外(P=1.000),其余各组组间有差异(P<0.05),MMP-9浓度表达逐渐下降,最后维持在较低水平。 3.TGF-β1、Smad2、Smad3、MMP-9之间的相关性 经Spearman相关分析结果显示,在人ESC中,浓度梯度TGF-β1刺激后,MMP-9表达与TGF-β1呈负相关(r=-0.950、P=0.000)。TGF-β1与smad3表达呈正相关(r=0.921、P=0.000)。TGF-β1与smad2表达无相关(r=0.139、P=0.516)。 结论: 1.人ESC体系中,TGF-β1刺激达一定浓度后,模拟细胞纤维化环境,ESC的Smad通路激活,Smad3表达升高,推测TGF-β1以Smad3蛋白通路为主,下传胞内信号。TGF-β1达20ng/ml时,细胞表达Smad3蛋白能力达饱和状态。 2.人ESC体系中,TGF-β1刺激浓度不断升高,Smad2表达无改变,推测Smad2可能未参与TGF-β1细胞内信号通路的传导。 3.人ESC体系中,TGF-β1刺激浓度不断升高,MMP-9表达逐渐下降,证实TGF-β1负调控ESC表达MMP-9,TGF-β1达20ng/ml后,MMP-9表达受抑制降至最低水平。 4.MMP-9表达与TGF-β1呈负相关,TGF-β1与smad3表达呈正相关,TGF-β1与smad2表达无相关。推测TGF-β1可能主要通过Smad3通路下调MMP-9的表达,参与调节ECM代谢。 5.在ESC上TGF-β1浓度达1ng/ml时,Smad3蛋白表达开始升高,浓度达2.5ng/ml时MMP-9表达开始下降,Smad3和MMP-9两者改变不同步,推测TGF-β1在ESC上另有下游调节通路存在,可能与Smad通路相互影响。 小结: 1.IUA患者子宫内膜腺体细胞及基质细胞均可表达TGF-β1与MMP-9。 2.IUA患者子宫内膜组织表达TGF-β1和MMP-9水平呈显著负相关,TGF-β1可能通过负调控MMP-9参与IUA的形成。 3.体外成功分离培养及传代子宫内膜基质细胞,具有稳定的成纤维细胞特性。 4.人ESC处于纤维化环境时,TGF-β1以Smad3通路为主,下调MMP-9的表达,参与调节ECM代谢。