子宫颈癌的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位,是引起女性患者死亡最常见的妇科恶性肿瘤之一。子宫颈癌的发病年龄呈现出愈来愈年轻化趋势,这可能与性生活的过早发生、性伴侣多、性生活不注意清洁卫生等相关。高危型(又称致癌型)人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发生、发展的必要因素。在确定的15种高危型HPV类型中,HPV18和HPV16是最常见的两种,最新的研究揭示,它们与将近70%的宫颈癌相关。细胞周期调控与宫颈恶性肿瘤发生、发展关系的研究近年来成为热点。P19ARF是新发现的重要的抑癌基因,它来源于细胞周期性蛋白依赖酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor CDKI)家族中的INK4a (inhibitor of CDK4),在小鼠胚胎表达为P14ARF,在人类编码同源物是分子量为14KD的P19ARF蛋白,它是INK4a/ARF基因通过变更剪接编码出的与P16Ink4a的阅读框不同的蛋白质。P19ARF是重要的抑癌基因P53的上游基因,能够通过P19ARF-MDM2-P53途径,直接结合MDM2或者发挥核定位功能,减少MDM2对P53的降解,使P53积聚,稳定性升高。其通过非磷酸化的视网膜癌蛋白RB在细胞周期的重要作用使细胞周期于G1-S期发生停滞或直接诱导细胞凋亡,而达到抑制细胞的无限制增殖。P18Ink4c是同P19ARF一样也属于CDKI。其作用方式主要是通过抑制周期蛋白D与周期蛋白激酶CDK4／6结合,以及P18Ink4c自身与CDK4／6特异性结合起作用,抑制该两种复合物磷酸化酶功能,从而达到抑制磷酸化蛋白RB的活性的作用。非磷酸化的RB能够抑制E2F在E2F-RB复合物中的释放,转录因子E2F不能启动遗传物质的转录,使相关的周期蛋白依赖性激酶失活,限制细胞周期通过检测点,细胞周期停滞。P18Ink4c恰好抑制RB的磷酸化,限制细胞通G1-S期限制点,抑制细胞无限制增殖。目的采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,研究宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)、正常宫颈组织中人类P19ARFmRNA、P18Ink4cmRNA的表达情况,应用免疫组织化学方法(S-P法)研究两种蛋白的阳性表达情况,探讨该两种因子在宫颈癌发病中的表达及临床意义,为宫颈癌的临床诊断和治疗提供新的思路。材料和方法1材料选取郑州大学第三附属医院2011年1月至2012年1月在门诊行宫颈活检术或者住院手术治疗的子宫颈癌标本47例,CIN20例；同期因子宫腺肌症或子宫肌瘤行全子宫切除的正常子宫颈组织20例。宫颈癌标本按照国际FIGO分期I期21例,II期20例,III期3例,IV期3例；按照病理学分级G1级19例,G2级15例,G3级13例；17例患者有淋巴结转移,30例患者无淋巴结转移；所有标本经病理学证实,均无放疗、化疗及免疫学治疗病史。所有标本于切下后5min取材,严格遵守无菌原则,一部分取材后迅速置于-80℃液氮中保存,另一部分置于10%甲醛固定后进行石蜡包埋,4μm连续切片。2实验方法2.1实验方法和主要试剂采用采用免疫组织化学方法(S-P法)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法进行检测。免疫组化SP试剂盒,DAB染色剂均购自北京生物博奥森有限公司。一抗P18Ink4c多克隆抗体购自北京生物博奥森有限公司,P19ARF多克隆抗体购自santa cruz生物试剂有限公司。2.2免疫组织化学方法标本经10%甲醛固定,严格按照试剂盒说明书进行操作,用石蜡包埋,以均匀4μm厚度进行切片。P18Ink4c和P19ARF蛋白阳性结果判定标准：在400倍显微镜下随机计数5个视野,根据染色强度及阳性细胞占总细胞数的比例(阳性率)同时评分。根据染色强度进行评分：基本无着色为0分、弱阳性为1分、强阳性为3分,介于二者之间为2分；根据阳性率进行评分：≤5%为0分,6%-25%为1分,26%-50%为2分,>50%为3分。两种评分的乘积判定阳性结果。0-2分为阴性,3-9分为阳性。2.3RT-PCR设计引物,组织总RNA提取后,进行聚合酶链反应。PCR扩增产物采用琼脂凝胶电泳,在紫外线投射仪下观察电泳条带,用D-140图像记录分析系统进行分析,目的基因的表达量以目的DNA条带和ACTIN条带的灰度值比值计算。3统计学方法采用SPSS17.0统计软件包进行数据处理,采用K-W检验、X2检验、Fisher’s确切概率法等。检验标准：a=0.05结果1P19ARF mRNA在不同宫颈组织中的表达P19ARF mRNA在586bp处显示有清晰明亮的条带。在三组中均有表达,在宫颈癌组的表达量为0.098±0.005,明显低于CIN组和正常宫颈组(0.502±0.009,0.915±0.027),表达量依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。2P18ARF蛋白在不同宫颈组织中的表达P19ARF蛋白在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌中主要表达于胞浆和胞膜,随病变程度的加重,染色强度逐渐减轻,阳性细胞比例依次降低,其阳性率分别为80%、45%、21.28%,差异有统计学意义(P<0.05)。3P19ARF蛋白与宫颈癌病临床理特征的关系P19ARF与淋巴结转移有关,在伴随淋巴结转移的宫颈癌组织中,P19ARF的表达率降低,差异有统计学意义(P<0.05),其在宫颈癌I期的阳性表达率高于其他分期,但差异无统计学意义(P>0.05)。与宫颈癌组织学分级、组织学类型无关(P>0.05)。4P18Ink4cmRNA在不同宫颈组织中的表达P18Ink4cmRNA在479bp处有清晰明亮的条带。条带亮度在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌组织中呈现递增水平变化。P18Ink4cmRNA的表达量为依次升高,分别为0.187±0.002,0.331±0.006,0.616±0.009。差异具有统计学意义(P<0.05)。5P18Ink4c蛋白在不同宫颈组织中的表达18Ink4c蛋白在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌中主要表达于胞浆和胞膜,随着病变程度的加重,染色强度逐渐加重,阳性细胞比例依次升高,阳性表达率依次升高,分别为10%、45%、65.96%,差异有统计学意义(P<0.05)。6P18Ink4c蛋白与宫颈癌病临床理特征的关系P18Ink4c与宫颈癌分期、淋巴结转移有关,伴随着淋巴结转移、分期的增加其表达率也增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与宫颈癌组织学分级、组织学类型无关(P>0.05)。7宫颈癌中P19ARF和P18Ink4c关联性分析RT-PCR结果显示P18Ink4c和P19ARF不存在简单线性关系,免疫组化结果显示宫颈癌组织中P18Ink4c和P19ARF无明显相关性(P>0.05)。结论1.在宫颈癌组织中人类P19ARF和P18Ink4c的基因水平和蛋白水平均有异常表达。2.人类P19ARF的低表达P18Ink4c的高表达可能参与了宫颈癌的发生、发展的过程。