论文部分内容阅读
已有的研究资料向人们清楚地显示,亚溶破MAC可活化多种细胞生物学效应,是体内补体过度活化病理效应的重要介导者之一。虽然已经发现MAC沉积后可活化细胞内多种胞内信号分子,但MAC插入膜上后通过何种机制介导胞内信号途径的活化目前仍不清楚。已知MAC插入质膜不需任何受体,除了与已知的两种终末补体调控蛋白C8bp和CD59结合外,目前尚未证实沉积于细胞表面MAC与其它的分子有直接的相互作用。那么,MAC的跨膜信号转导机制究竟是什么?作为一个高度亲脂性蛋白,插入膜上的MAC引起细胞信号传导入脑究竟有什么特殊之处? 近年研究发现,哺乳动物细胞质膜表面存在主要由糖鞘脂(GSL)、鞘磷脂(SM)及胆固醇聚集形成的膜微区结构,GPI锚固蛋白及其他一些膜分子,特别是一些重要的信号转导分子如Src家族PTK、异三聚体G蛋白等,相对特异性聚集于其中。Caveolae是多种细胞表面的膜微区形式,因具有特征性的烧瓶样质膜内陷和特征性的结构蛋白caveolin而可与其它的膜微区相区别。大量的研究显示,质膜上的这些膜局限性结构域中聚集着许多重要跨膜信号转导分子,在细胞跨膜信号转导中发挥重要作用。此外,越来越多的细胞生物学行为包括内吞、物质的跨膜转运、膜蛋白的定向分选等均被发现与膜微区的功能相联系。对生理状态下膜微区结构和功能的认识是一个目前研究非常活跃的领域。、在思索MAC的跨膜信号转导的可能机制中,我们发现了以下有意义的线索:第一,已经证实的多种参与MAC活化细胞的信号途径几乎无一例外地被证实与质膜微区相联系,提示MAC可能与caveolae有功能上的联系。第二,MAC在膜上的天然受体C8bP和CD59均为GPI-锚固型蛋白,近年的研究证实W-锚固蛋白成簇分布于膜微区之中。而这些调控蛋白在细胞表面高表达,可迅速地与沉积在膜上的MAC相结合。那么,特异性地定位于特殊的膜微区之中的 CD59儿8bP对 MAC的分布有何影响?是否可介导 MAC定位于膜微区之中?第三,MAC作为高度亲脂性的复合物,沉积于膜上后可与脂质分子结合,形成胶束区并引起膜脂质重排。那么,MAC是否可与质膜上大量散在分布的膜微区相互作用? 基于以上的分析,我们大胆设想,MAC沉积至细胞膜上后,可通过与脂质的相互作用而与膜微区产生物理上和功能上的联系。为探明沉积于细胞表面的MAC与膜微区的关系,我们以人血管内皮细胞为模型,建立MAC亚溶破体系并检测其刺激效应:纯化内皮细胞表面的caveolae结构,检测MAC与caved 富集的膜区段之间的关系以及特异性破坏caveolae对MAC介导的内皮细胞活化效应的影响。我们期望通过这一研究,更多地了解MAC与膜上脂质分子的相互作用情况,并从一个新的角度认识eC可能的跨膜信号转导机制。本文的主要研究内容及结果包括: 1.以纯化的补体终末成分体外组装MAC,并以之建立内皮细胞亚溶破模型。其中CS的活化通过蛋氨酸氧化的方法在不裂解CS的条件下获得。这种体外组装策略保证了体系中的刺激因素是真正功能纯的MAC,为进一步深入研究MAC的病理效应及其信号转导机制奠定了良好的基础。 2.在MAC的内皮细胞亚溶破模型中,多角度地检测了亚溶破剂量的MAC对内皮细胞的两种不同途径的分泌----P小体分泌反应和需基因转录的新蛋白合成分泌途径的活化效应,并以激光共聚焦显微镜动态观察MAC沉积引起胞浆*a‘”j i的变化。结果发现,eC可刺激内皮细胞 W干 ’J’体分泌反应,引起 VWF因子快速释放出胞:亚溶破剂量 MAC可诱导 IL士趋化因子的蛋白合成及分泌;激光共聚焦显微镜下观测到MAC沉积后引起 ·Vlll·的胞浆*a’”j i增高和钙振荡,并发现不同的细胞在 MAC沉积后*a‘”j i变化模式存在异质性。 3.低温条件下以非离子型去污剂Trtion《 100纯化内皮细胞表面的caveolae结构,检测沉积于细胞表面的MAC在蔗糖密度梯度离心场中的位置。结果显示,沉积于膜上的MAC特征性地浓聚于低密度去污剂不溶性膜区段中,该区段同时有caveolin的富集,提示MAC与caveolae存在直接的物理联系。以甘露糖胺抑制内皮细胞GPI-锚固蛋白的表达,补体终末成分的分布无明显改变,说明MAC的caveolae分布特性不依赖GPI-锚固蛋白CD59。这是首次报道沉积于质膜表面的MAC与caveolae存在直接的物理联系。 4.在证实MAC与cave01ae徽区结构有直接的物理联系的基础上,以胆固醇结合剂Fn 和Nystatin特异性地破坏细胞表面册veolae结构和功能,观测其对MAC介导的内皮细胞刺激效应的可能影响。结果显示,特异性地破坏caveolae的结构与功能使MAC刺激内皮细胞分泌几E的效应明显减低,但对VWF的分泌没有影响,提示MAC对胞内信号活化依赖caveolae微区结构。此外,特异性抑伟聚集于caveolae 中的Src家族PTK活性后,MAC刺激内皮细胞分泌几干的效应也显著地受到抑制。这一结果提示,eC沉积于细胞表面后,可活化聚集于caveolae中的非