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肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。抑癌基因启动子高甲基化被认为是抑癌基因失活的最重要机制之一寻找和验证新的抑癌基因对探索肝癌新的分子发病机制具有重要意义。RAS基因是一类具有重要生理功能的编码基因,研究证实,RAS信号通路的激活与多种肿瘤有关。RAS结构相关家族基因(The Ras-Association Domain Family, RASSF)是一组新近发现的RAS家族相关基因,包含RAS相关结构域,能够与RAS编码的癌基因蛋白结合,起负调控的作用。RASSF家族包含RASSF1-RASSF10的10个家族成员。RASSF10是最新发现的RASSF家族成员,目前关于RASSF10在肿瘤中的研究较少。我们的前期实验显示,RASSF10在肝癌细胞株中有基因表达抑制及启动子高甲基化现象,它在肝癌的发生发展中的作用需要进一步的深入研究。本研究首先分析RASSF10基因表达情况与基因启动子甲基化的相关性；通过体内外实验明确RASSF10对肝癌生物学行为(细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移)的影响；筛选RASSF10基因调控的与侵袭转移相关的下游靶基因并进行验证,进一步阐明RASSF10在肝癌发生发展中的分子机制,并为有效治疗肝癌提供新思路。研究步骤1. RASSF10在肝癌中的表达情况及与基因启动子甲基化之间的相关性①qPCR检测20对肝癌及配对癌旁正常组织中RASSF10基因mRNA表达水平；RT-PCR检测8种肝癌细胞株及正常肝组织中的RASSF10基因mRNA表达水平；②对不同肝癌细胞株进行了5-Aza-DC去甲基化处理,RT-PCR检测药物处理前后RASSF10基因mRNA表达情况；③甲基化特异PCR(MSP)及亚硫酸氢盐-基因组测序法(BGS)检测不同肝癌细胞株及正常肝癌组织启动子甲基化情况；2.RASSF10对肝癌生物学行为的影响①筛选RASSF10表达沉默的肝癌细胞株HepG2和QGY7703,基因转染过表达RASSF10,通过克隆形成实验和MTS实验观察RASSF10对肝癌细胞增殖的影响；②采用流式细胞仪分析RASSF10对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响；Western blot检测RASSF10对凋亡和周期相关蛋白的影响；③裸鼠皮下荷瘤模型验证过表达RASSF10对肝癌生长的影响；④Transwell实验研究RASSF10对肝癌细胞迁移及侵袭的影响；3.RASSF10调控靶基因及侵袭转移相关信号通路的研究①在稳定转染RASSF10的QGY7703肝癌细胞中利用adhesion基因PCR阵列分析筛选出与侵袭转移相关的下游靶基因。对其中11个候选靶基因进行qPCR验证；②在稳定转染RASSF10的QGY7703肝癌细胞中外源性过表达MMP2后,Transwell侵袭实验进一步研究MMP2对肝癌细胞侵袭功能的影响；③Western blot检测RASSF10引起的MMP2表达下调和FAK信号通路之间的关系；研究结果1.基因启动子DNA甲基化是RASSF10表达下调的重要调控机制①RASSF10在肝癌组织中mRNA表达水平较配对癌旁正常组织明显下调(p=0.003,n=20)；与正常肝组织相比,在62.5%(5/8)肝癌细胞株中RASSF10呈现显著低表达或沉默表达。②在低表达或沉默表达的5个肝癌细胞株(HepG2, Hep3B, BEL7404, QGY7701和QGY7703)中,经启动子去甲基化药物(5-aza-DC)处理后RASSF10基因的mRNA表达水平恢复或增强。③MSP检测发现RASSF10基因启动子在5个低表达RASSF10的肝癌细胞株(HepG2, Hep3B, BEL7404, QGY7701和QGY7703)中出现全部甲基化或部分高甲基化。BGS测序结果与MSP检测基本相一致。2.RASSF10能抑制肝癌的生长和侵袭①外源性过表达RASSF10能明显抑制肝癌细胞株HepG2和QGY7703的增殖(p<0.01)。②流式细胞术显示RASSF10对肝癌细胞HepG2和QGY7703的凋亡作用不明显,但能明显增加肝癌细胞进入G1期的比例。Western blot检测周期相关蛋白的表达,结果显示,过表达RASSF1O后,QGY7703细胞中周期相关蛋白P21,P27表达明显上调,CylinD1, CDK2蛋白表达明显下调。③裸鼠肝癌皮下成瘤实验发现过表达RASSF10能显著抑制肿瘤的生长(p<0.01)④过表达RASSF10能显著抑制HepG2和QGY7703细胞的迁移(p<0.01)和侵袭(p<0.05)3.RASSF10调控多个与侵袭转移相关的下游靶基因,并参与转移相关通路的调控①筛选出与侵袭转移相关的下游靶基因：13个上调基因和8个下调基因。这些基因主要参与细胞粘附、迁移和侵袭等重要细胞生物学功能。qPCR对其中11个候选靶基因验证发现,其中ADAMTS1, ADAMTS13, ITGA6, PECAM1和TIMP2的mRNA水平明显升高,而ITGB2, MMP2和TGFBI的mRNA水平明显下降,其结果与基因阵列分析吻合。其中以MMP2的改变最为显著。②在稳定转染RASSF10的QGY7703肝癌细胞中,外源性上调MMP2的表达后,发现RASSF10对肝癌细胞侵袭的抑制作用被逆转(p<0.01)。③稳定转染RASSF10的QGY7703肝癌细胞中,进一步检测RASSF10引起的MMP2表达下调与FAK信号通路之间的关系,发现FAK,pFAKY397和pFAKY925蛋白表达水平亦明显降低。研究结论1.体内外实验证实RASSF10在肝癌中表达呈显著下调,而且RASSF10基因在肝癌中的表达下调与基因启动子DNA甲基化密切相关。2.过表达RASSF10能明显抑制肝癌的生长和肿瘤侵袭。3.筛选到RASSF10调控的侵袭转移相关系列下游基因,这些基因主要参与肿瘤细胞粘附侵袭等生物学过程。并发现RASSF10可能通过FAK信号通路下调靶基因MMP2,从而抑制肝癌细胞的侵袭过程。