论文部分内容阅读
糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常见也是最严重的微血管并发症之一,严重威胁着人类健康。免疫系统激活、微炎症状态是目前一致认可的糖尿病肾病发病机制,如何克服免疫炎症反应,阻止和延缓DKD的进程,是糖尿病肾病防治领域的重要课题。巨噬细胞是关键的免疫炎症效应细胞。糖尿病环境下,肾脏局部巨噬细胞浸润,并活化为促炎M1型,产生多种炎性细胞因子、趋化因子、促纤维化因子等,改变肾脏局部微环境,引起肾小球损伤、结构重塑、硬化,小管萎缩,间质炎症及纤维化等。巨噬细胞从静息状态至促炎M1型经典活化状态发生了糖代谢重编程(从静止转变为活跃代谢状态)。M1型巨噬细胞主要依靠快速供能的有氧糖酵解途径获取能量及中间介质以发挥促炎效应。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)是细胞代谢重编程的关键酶,是糖酵解最重要的限速酶。生理状态下,PKM2以高激酶活性的四聚体构象存在于细胞质内,能与其他糖代谢酶,如己糖激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等构成复合体驱动三羧酸循环,调节细胞的能量代谢。微环境刺激下,PKM2四聚体解离为低活性的二聚体易位至细胞核,作为转录因子,驱动糖酵解进程。核PKM2是巨噬细胞活化M1的关键决定因素。因此,在糖尿病状态下,基于免疫代谢酶点深入研究巨噬细胞相关的肾损伤机制,以筛选出防治DKD新的作用靶点,具有重要的理论及临床意义。中医药在延缓糖尿病肾病病情进展方面具有不可替代的优势。中药黄蜀葵花及其制剂目前已成为治疗糖尿病肾病、慢性肾炎等慢性肾脏病的重要药物。本研究以db/db小鼠及RAW264.7巨噬细胞为研究对象,探讨黄蜀葵花醇提取物-黄葵素对DKD肾脏的保护作用,及其机制是否与巨噬细胞浸润、活化相关,进一步探寻其中可能作用靶点,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病的药理机制提供新的实验依据。目的:从动物和细胞水平,应用分子生物学实验技术,观察黄葵素对db/db小鼠肾组织炎症、纤维化的影响,并初步探明其中机制是否与调控M2型丙酮酸激酶(PKM2)及M1型巨噬细胞浸润、活化相关,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病提供科学依据。方法:1.动物实验:20只雄性db/db小鼠按随机数字表法均分为黄葵素低剂量、中剂量、高剂量治疗组(97.5mg/kg/d,195mg/kg/d,390mg/kg/d)及糖尿病肾病模型组,每组各5只小鼠,空白对照组用5只相同背景的db/m小鼠。黄葵素治疗组分别相应剂量黄葵素混悬液灌胃,对照组及模型组以等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。连续给药16周,期间定期检测尿ACR。第24周处死小鼠并收集标本。HE染色和Masson染色观察肾脏形态学改变和肾纤维化程度;免疫组化染色法检测肾组织F4/80标记的巨噬细胞表达情况;蛋白质印迹法检测F4/80蛋白、III型胶原蛋白、波形蛋白、iNOS蛋白和PKM2蛋白表达情况;RT-qPCR法检测TNF-α、IL-1β、iNOS和PKM2基因的mRNA表达情况;ELISA法检测血清TNF-α、MCP-1水平。2.细胞实验:CCK-8法检测不同浓度梯度的黄葵素对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响,初步确定适宜浓度黄葵素进行后续药效学实验。不同糖浓度梯度刺激RAW264.7细胞,流式细胞术筛选巨噬细胞M1型活化最佳糖浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为低糖组,高糖组,高糖+黄葵素组,流式细胞术分析黄葵素对RAW264.7巨噬细胞M1型活化的影响,蛋白质印迹法检测PKM2蛋白表达,探讨量效关系。结果:1.与对照组db/m小鼠相比:糖尿病肾病模型组db/db小鼠体重明显上升(P<0.01);肾脏指数下降(P<0.01);尿ACR水平明显升高(P<0.01);血肌酐水平明显升高(123.50±17.91 vs 13.40±1.36,P<0.01),尿素氮水平明显升高(15.22±0.63 vs 6.53±1.38,P<0.01);肾脏病理损害明显、胶原纤维的沉积;免疫组化提示肾组织中标记F4/80的巨噬细胞浸润增多(P<0.05);肾组织中巨噬细胞标记F4/80蛋白、M1型巨噬细胞活化标志iNOS蛋白和mRNA、及炎症因子IL-1β、TNF-α基因的mRNA转录均增加(P<0.01);血清中促炎因子TNF-α、MCP-1水平升高(P<0.01);肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达明显上调(P<0.01);糖代谢重编程关键酶PKM2的蛋白和mRNA表达水平明显上调(P<0.01)。2.与DKD模型组小鼠相比:黄葵素组小鼠尿ACR水平均下降(P<0.05);黄葵素组小鼠血Scr、血BUN水平总体呈抑制的趋势,其中中剂量组血Scr和高剂量组血BUN水平显著下降(P<0.05),高剂量组血Scr下降水平更明显(P<0.01);黄葵素组小鼠肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达均降低,呈量效关系,中、高剂量治疗组降低更显著(P<0.01);黄葵素组小鼠F4/80标记的棕染细胞浸润呈不同程度降低,呈一定量效关系,中、高剂量组降低更明显(P<0.05);黄葵素组小鼠肾组织F4/80蛋白表达均下调,呈量效关系,高剂量组下调最明显(P<0.01),中剂量组次其次(P<0.05);黄葵素组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β和iNOS基因的mRNA转录均下调(P<0.01);黄葵素组小鼠血清中TNF-α、MCP-1水平均下调(P<0.05),高剂量组下调更显著(P<0.01);黄葵素组小鼠肾组织PKM2的蛋白和mRNA表达均呈不同程度的下调(P<0.05,P<0.01);但体重与肾脏指数方面,黄葵素组与DKD模型组差异无统计学意义(P>0.05)。3.细胞实验结果:高糖(30mM)刺激RAW264.7巨噬细胞后,PKM2蛋白表达上调(P<0.01),巨噬细胞M1型活化率上升(P<0.05);而经过25ug/ml、50ug/ml的黄葵素药液处理后,PKM2蛋白表达下调(P<0.01),M1型巨噬细胞活化率下降(P<0.05)。结论:1.黄葵素显著降低db/db小鼠蛋白尿水平,减轻db/db小鼠肾脏病理损伤,减少胶原纤维沉积,抑制肾纤维化程度,呈量效关系;2.黄葵素可抑制肾组织局部巨噬细胞浸润及M1型巨噬细胞活化,减轻肾组织炎症及纤维化,呈量效关系;3.黄葵素抑制M1型巨噬细胞活化作用,可能与调控PKM2表达相关。