原发性肝胆管结石(HL)是我国常见良性胆道疾病,其病变复杂,由于胆石成因尚未阐明,术后具有较高的结石复发率,制约着临床疗效的进一步提高。临床证实肝内胆管慢性增生性炎伴粘液的高分泌是导致结石形成的主要病变,粘蛋白(MUC)是粘液的重要组成部分,提示分泌型粘蛋白对于结石形成具有重要作用。探索分泌型粘蛋白的分子调控机制,尤其是上游信号转导通路,对于有效抑制或阻断信号下传级联事件甚为关键。既往研究表明,粘蛋白抗原与胆道的细菌感染之间存在密切关系。细菌感染,细菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS)可刺激胆管上皮细胞激活细胞因子和炎症介质,产生和分泌大量MUC(如MUC2、MUC5AC等)。在结石形成中MUC不仅是促成核因子,参与结石基质的构成,而且在结石的起动和增长过程中均有重要作用。新近研究表明LPS诱发的分泌型MUC的过表达可能是肝胆管结石发病过程中主要现象。表皮生长因子受体(EGFR)广泛分布于哺乳动物的上皮细胞,膜外区域能结合具有激动功能的多种配体。近期提出的上皮细胞“EGFR轴”上游信号通路,被认为是粘液高分泌较为普遍的信号转导途径。肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)参与不同上皮组织中转化生长因子-α(TGF-α)外功能区的切割、脱落。故推测TACE活化并作用于TGF-α有可能成为EGFR磷酸化及相关信号传导通路的关键调节步骤。为进一步探索分泌型MUC表达的调控机制,在国内外以往研究线索的基础上,我们提出了“EGFR轴”在HL发病过程中可能发挥关键作用的假设。本课题我们首先选择MUC1、MUC2、MUC3、MUC5AC及MUC6作为代表各型MUC的指标,研究采用免疫组化法和图像分析,检测肝胆管结石患者肝胆管组织和正常肝胆管组织中MUC的表达水平。结果显示正常肝内胆管上皮组织中不同种类的MUC有不同的表达率,而与正常肝胆管组织相比,分泌型粘蛋白MUC5AC在肝胆管结石胆管上皮细胞过表达,并与正常肝胆管组织中的表达差异性更为显著,客观上表明了分泌型MUC与肝胆管结石形成间的密切关系,同时也促使我们在肝胆管结石形成原因的研究中,将重点放在分泌型MUC产生和分泌的调控方面。通过研究分泌型粘蛋白MUC5AC表达上游信号转导通路,探讨分泌型粘蛋白MUC5AC表达的调控机制。通过体外模拟肝胆管结石临床病理过程中常见致病因素,我们以LPS为刺激物,检验在人肝内胆管内皮细胞株(HIBEC)产生和分泌MUC5AC的过程中,“EGFR轴”信号通路的关键因子TGF-α、TACE和EGFR等,在感染因素作用下的活化或表达变化情况,及其与粘蛋白MUC5AC产生和分泌之间的关系。实验结果提示,当给予HIBEC有效的LPS刺激,TACE的蛋白表达显著减弱,分泌型TGF-α表达非常显著地增强,同时EGFR的磷酸化水平显著增高,MUC5AC的mRNA和蛋白表达水平升高也非常显著,上述变化与空白对照组相比较均具有统计学意义。以上实验结果印证了我们初步假设的“EGFR轴”在HIBEC中是分泌型粘蛋白MUC5AC信号转导的一条主要通路,并提示TACE、TGF-α和EGFR在其中起到重要作用。为进一步研究MUC5AC表达的调控机制,我们针对“EGFR轴”信号通路中TACE、TGF-α和EGFR等关键因子进行了干预处理,以明确MUC5AC表达的关键调控点。结果显示HIBEC的TACE蛋白表达水平,能够被转染siRNA及其特定性阻滞剂TAPI-1显著下调,并阻断其作用的发挥,继而导致分泌型TGF-α表达下调,EGFR磷酸化水平下调,使LPS刺激不能引起MUC5AC的mRNA及蛋白水平显著的上调;而此后给予补充外源性TGF-α,能够逆转抑制作用,显著上调MUC5AC的mRNA及其蛋白水平的表达。AG1478因为仅能阻止TGF-α下游EGFR磷酸化活性作用,因此不能影响分泌型TGF-α的表达变化,但能够下调其下游产物MUC5AC的mRNA及蛋白水平;而给予外源性TGF-α,能够显著上调EGFR磷酸化水平。以上结果提示,在原发性肝胆管结石形成早期,肠源性革兰氏阴性杆菌成分LPS刺激胆管上皮细胞中TACE的活化,活化的TACE切割TGF-α,进而参与EGFR磷酸化,通过下游信号转导,最终导致分泌型MUC5AC的过表达,其中TACE切割TGF-α前体是“EGFR轴”激活的限制步骤,TGF-α依赖的EGFR磷酸化是其中心环节。通过我们的研究发现,在HIBEC中“EGFR轴”是分泌型粘蛋白MUC5AC信号转导的一条主要通路,如能针对“EGFR轴”的关键因子,如TACE、EGFR为靶点进行有效干预,有望抑制肝胆管上皮细胞受感染刺激后EGFR磷酸化,进而减少或阻断MUC的过度合成。而控制MUC的高表达和高分泌,将有助于抑制肝内胆管结石的形成,有望为审因论治肝内胆管结石,及预防复发性结石形成提供一条有效途径。