传统意义上,益生元是指可以被肠道中的有益菌选择性发酵,并特异性地促进有益菌的生长和/或活性,进而改善宿主健康的不消化物质。特异性富集双歧杆菌和乳杆菌的能力常作为益生元的判别标准。近年来,益生元概念被重新修订,是指一类可被肠道菌群代谢进而调节肠道菌群的组成和/或活性,起到改善宿主生理健康的不消化物质。益生元的评价往往通过体外模型、动物试验和临床试验三种方法结合来完成。体外批式发酵模型经济快速,广泛用于从大量食物成分中初筛潜在益生元物质,保障后续高成本的动物和临床研究的有效性。然而,同样基于批式发酵模型,不同研究者对同一种益生元调节肠道菌群作用的报道往往不相一致。本论文通过分析产生这种不一致的因素,如发酵模型的营养类型、评价参照系以及菌群分析方法,来建立优化的益生元体外评价方法,以作为使该模型标准化的基础。首先采用寡营养和富营养两种营养类型的体外批式发模型,观察接种了健康人肠道菌群后菌群结构和活性的变化情况。两种营养类型分成5个处理,分别是寡营养的磷酸盐缓冲液培养基(低蛋白质低胆汁酸盐)接种粪悬液至终浓度为5%(P5)、10%(P10)和16%(P16),和富营养培养基(高蛋白高胆汁酸盐)接种粪悬液至1%(B1)和5%(B5),以培养0时刻为基线对照,以未加益生元组为阴性对照。采用变性梯度凝胶电泳和454焦磷酸测序技术监测菌群,对代谢物进行pH、短链脂肪酸和胆汁酸盐测定。结果显示:接种菌群在寡营养的三种处理中变化较小,且变化特征一致;而在富营养的两种处理中变化较大,特征不同。从菌群随时间变化的特征来看,富营养的B1模型中出现了高脂高蛋白饮食人群中普遍存在的菌群失调特征,即蛋白质分解菌和胆汁酸盐耐受菌丰度大幅增加,胆汁酸盐敏感菌丰度大幅下降甚至被清除。本研究表明,寡营养和富营养模型中的营养成分对接种菌群具有显著的影响,因此,在应用体外模型评价益生元作用时不仅需要基线对照,也必须纳入阴性对照,以更好地揭示益生元对菌群的调节作用。B1模型的菌群变化特征类似于高脂高蛋白饮食人群中普遍存在的菌群失调特征,而P5模型能够代表低蛋白质低胆汁酸的肠道营养环境,因此,在后续分析中选择了P5和B1体系分别作为寡营养和富营养模型的代表。为了进一步考察发酵模型和菌群分析方法对益生元评价结果的影响,我们在P5和B1模型中,对一种益生元配方对肠道菌群的调节作用进行了体外评价。基于焦磷酸测序的菌群分析结果显示,益生元在两种模型中均显著调节了肠道菌群,但调节的作用存在明显差异。在挑选出的50个被益生元调节的关键OTU中,仅8个在两体系中的变化一致(7个升高,1个降低)。P5中,益生元富集了Faecalibacterium和Prevotella等;B1中,益生元富集了Faecalibacterium、Bacteroides、Bifidobacterium和Lactobacillus等,抑制了Streptococcus、Escherichia/Shigella和Bilophila等。此外,益生元还调节了大量目前功能尚难以确定或研究尚不充分的肠道共生菌,例如Oscillibacter、Dialister和Alistipes属的细菌等。此外,在相同处理之下,同一个菌属内的不同种(OTU)对益生元的响应存在差异。因此,传统基于靶向菌群分析手段所揭示的益生元调节肠道菌群的作用,有待运用高通量测序等非靶向菌群分析技术,并在物种水平重新分析和认识。综上,考虑到P5和B1模型中益生元评价结果存在显著差异,以及两种模型在营养特征上各自具有一定的代表性,我们提出了一套优化的益生元体外评价方法:寡营养和富营养模型同时使用,与阴性对照进行比较,采用非靶向的二代测序菌群分析技术,并在种的水平揭示益生元对菌群的调节作用。最后,运用上述方法评价了低聚果糖和抗性糊精对人体肠道菌群结构和功能的调节作用。结果显示,两种益生元均可显著调节肠道菌群,抑制机会性致病菌的作用相似,富集有益菌的偏好不同。低聚果糖在寡营养体系富集了丁酸盐产生菌Faecalibacterium,在富营养体系富集了Blautia、Lactobacillus、un_Lachnospiraceae、Faecalibacterium、Megamonas和Bifidobacterium。抗性糊精在两种营养体系均主要富集了un_Lachnospiraceae。相应地,两种益生元抑制蛋白特异性发酵产物支链脂肪酸的效应相似,累积有益短链脂肪酸的偏好不同。低聚果糖富集乙酸的作用强,富集高浓度丁酸的作用依赖于寡营养发酵环境;抗性糊精可稳定地富集丙酸和丁酸。基于Caco-2细胞模型评价发酵代谢物的功能的结果显示,低聚果糖在寡营养模型对菌群代谢物的调节具有促进肠上皮细胞生长的作用,其他情况均无明显效应。综上,在调节菌群组成方面,低聚果糖的作用更优;在对菌群代谢物影响肠上皮细胞的功能调节方面,低聚果糖存在优势,但这种优势依赖于寡营养的发酵营养环境;在累积丁酸的作用方面,抗性糊精在寡营养和富营养模型中均能累积高浓度丁酸。本研究提出了优化的益生元体外评价方法,并以此方法比较了两种公认的益生元物质对人体肠道菌群结构和功能的体外调节作用,论证了这一方法在用于益生元的比较和筛选中具有灵敏性和有效性,为益生元体外发酵评价方法的标准化奠定了基础。