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肝癌在我国发病率位居第四,致死率高居第二位。治疗过程中抗肿瘤药物不仅对肿瘤细胞具有杀伤作用,而且会对体内的正常细胞产生严重损伤,长期给药后影响机体的正常功能,肿瘤细胞还易产生多药耐药性,导致患者的存活率不高。依托我国特有的中医药理论,研发高效低毒的抗肿瘤药物已然成为研究的热点。而莪术醇就是已发现的具有抗肿瘤活性的中药成分之一,早在70年代就被写入抗癌扶正方,其药理作用包括抗肿瘤、抗病毒、抗炎等,但由于其水溶性极低,限制了其在临床上的应用。莪术醇衍生物CD-2e对肝癌HepG2细胞的抗肿瘤活性研究。本课题组通过对莪术醇的羟基位置进行修饰,接入含氮杂环等活性基团,得到了一系列莪术醇衍生物,通过对其抗肿瘤活性、水溶性和性状的综合考量,最终选择莪术醇衍生物CD-2e作为进一步研究的对象。首先利用MTT比色法比较莪术醇衍生物CD-2e对肝癌HepG2细胞、慢性粒细胞白血病K562细胞、结肠腺癌Caco2细胞及胃癌MKN45细胞的半数抑制浓度IC50值,测定结果分别为96.39±0.71μM、257.08±1.69μM、215.65±1.22μM、158.33±0.81μM,与相同浓度的莪术醇进行对比,结构改造后的化合物对于以上几种肿瘤细胞的增殖抑制作用均有加强,对肝癌HepG2细胞的作用效果最佳,因此选择肝癌HepG2细胞作为后续莪术醇衍生物CD-2e抗肿瘤活性研究的对象。克隆形成抑制实验是测定细胞活性和增殖能力的有效方法,实验发现浓度为50μM和100μM的莪术醇衍生物CD-2e作用下集落数量分别为莪术醇组的80%和50%,说明莪术醇衍生物CD-2e对HepG2细胞的活性和增殖能力抑制作用更强。应用流式细胞仪测定莪术醇衍生物CD-2e对细胞凋亡的影响,从实验结果可以看出CD-2e可以诱导肝癌HepG2细胞凋亡使其阻滞在S期。AO-EB双染实验中观察到随着作用时间的延长,HepG2细胞凋亡,染料透过死细胞膜,使其呈现橙黄色荧光,部分细胞破裂。此外,本课题还从蛋白水平考察了莪术醇衍生物CD-2e对肝癌HepG2细胞的作用,结果显示,莪术醇衍生物对Total-JNK、P-JNK1表达抑制作用明显,对JNK2和P-JNK2表达无明显抑制作用,与文献中报道的通过JNK通路抑制原发性肝癌的内容相符合。载莪术醇衍生物CD-2e的PEG-PCL胶束的制备。莪术醇衍生物CD-2e结构修饰后,虽然水溶性提高但是logP值仍略大于1,需要采用制剂手段提高莪术醇衍生物CD-2e的溶解度,从而提高其抗肿瘤效果。具体实验过程为:首先利用计算机辅助药物设计对载莪术醇衍生物CD-2e的PEG-PCL胶束形成过程进行分子动力学模拟,推测制剂方法的可行性。然后通过单因素考察法、正交设计法对载莪术醇衍生物CD-2e的PEG-PCL胶束的处方进行筛选。确定最优处方为:药质比1:4、水化体积20mL、水化温度60℃、水化时间4h,以最优处方制得载药胶束后进行表征,所制得的胶束粒径分布均匀,平均粒径在190nm左右,包封率可达到90%。胶束体外稳定性较好,4℃和25℃下放置14天,粒径、PDI和Zeta电位稳定。在pH6.5和pH7.4条件下进行体外释放实验,在两种pH中均无突释现象,在弱酸性环境中胶束的累积释放可达到84%。细胞摄取实验中发现PEG-PCL胶束可被HepG2细胞摄取,进入肿瘤细胞内弱酸环境后载药胶束可以更充分的释放药物,达到更好的抗肿瘤效果。药动学实验结果也表明载莪术醇衍生物CD-2e的PEG-PCL胶束相较于单纯的莪术醇衍生物CD-2e静脉注射给药后在体内循环时间更长,AUC更大,生物利用度明显提高。通过上述实验研究得出以下结论:莪术醇衍生物CD-2e可以通过抑制Total-JNK、P-JNK1蛋白表达和将HepG2细胞阻滞在S期的方式诱导其凋亡。将其制备为载莪术醇衍生物CD-2e的PEG-PCL胶束可以提高其溶解度,延长体循环时间,增加生物利用度。