论文部分内容阅读
目的 日本血吸虫病属我国规划防治的严重寄生虫病之一,现有血吸虫病疫苗由于各种不足均未能应用于临床,因此,开发新型疫苗是预防该病的必经之路。本研究拟扩增日本血吸虫(Schistosoma japonicum, Sj)32抗原编码基因,以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)为“载体”,构建日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗,并进一步观察该疫苗诱导BALB/c鼠免疫反应的动态变化,为日本血吸虫病的防治提供一种新型疫苗。方法1.从本室保存的BL21(pET28a-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28a-Sj32,并以该质粒为模板,PCR扩增得到Sj32抗原编码基因,利用基因重组技术将此目的基因插入载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj32,以电穿孔法将其转化到Bb中,获得重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗；仍采用电穿孔法将pGEX-Sj32转化至大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)中加IPTG诱导表达,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)技术鉴定其表达产物。2.将重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗分别经口服(Per os,PO)和滴鼻(Intranasal,IN)途径免疫BALB/c鼠,动态观察免疫后0-20周该疫苗所诱导的免疫应答变化,以常规ELISA法检测血清抗体IgG及其亚类、IgE和IgA水平,双抗体夹心ELISA法检测血清细胞因子及脾细胞培养液中细胞因子(TNF-α、IL-10和IL-12)的动态变化,四甲基偶氮唑盐比色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分析免疫后不同时间点脾脏淋巴细胞增殖水平、流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测小鼠脾脏中T细胞(CD4+T和CD8+T)亚群分化和脾细胞凋亡率。结果1.成功扩增出长度为1270 bp的Sj32抗原编码基因；双酶切证实质粒pGEX-1λT与Sj32基因重组成功；在重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗中PCR扩增出1270 bp的Sj32基因片段,与目的基因长度相符；重组质粒pGEX-Sj32可在大肠埃希菌中被IPTG诱导后的表达产物经SDS-PAGE电泳证实为相对分子质量约58 kDa的重组蛋白,以诱导后5-7 h表达效率较高；Western blot显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染的兔血清所识别。2.动态研究表明：(1)血清抗体及细胞因子PO组血清抗体IgG及其亚类IgG1、 IgG2a, IgG2b、IgG3和IgA均于8周达最高水平,而IN组除IgG2b和Ig3于12周、IgE于14周达较高水平外,其余均于8周达最高值；两组血清细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α分别在免疫后(PO组)14、6和8周及(IN组)8、6和8周达最高水平；(2)脾细胞增殖及细胞因子变化PO组和IN组脾细胞增殖均于免疫后6周达最高值；分别于6周和8周达最大脾细胞凋亡发生率；脾CD4+T细胞亚群百分比分别在6周和8周达最高值,而两组CD8+T细胞亚群百分比在免疫后2-20周升高不显著,与0周相比无统计学差异；PO组脾细胞因子IL-10、IL-12和TNF-α水平均分别于免疫后10周、6周和8周达最大值,IN组分别在12周、8周和8周达最大值。结论1.成功将目的基因Sj32与载体连接,得到重组质粒pGEX-Sj32,2.pGEX-Sj32被成功引入Bb获得了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗；3.重组质粒在大肠埃希菌中能表达58 kDa的重组蛋白,且具有较强的免疫原性；4.重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗能够诱导BALB/c鼠产生有效的免疫应答。