论文部分内容阅读
研究背景胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,具有异质性大、恶性程度高、预后差和病死率高等特点。近年来治疗手段的进步极大地改善了患者的预后,但胶质瘤患者术后总体生存期仍无突破性延长,因此针对胶质瘤的诊断标志物的筛选和对胶质瘤恶性演变机制的研究仍需要研究。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）作为长度超过200bp的不能编码形成蛋白的基因。越来越多的研究表明,许多lncRNA在在肝癌、白血病、肺腺癌、前列腺癌和结肠直肠等癌组织中异常表达并和患者的预后相关,并参与肿瘤细胞的形成和发展以发挥重要功能。研究目的本研究拟通过生物信息学分析,选定LUCAT1为本研究的关键lncRNA。通过生物信息学挖掘和体外细胞实验来探索LUCAT1在胶质瘤中的潜在作用机制及在胶质瘤预后的评估价值,为胶质瘤患者的预后评估提供新的生物标志物。研究方法第一部分:生物信息学分析使用生物信息学方法寻找胶质瘤的lncRNA标志物;通过GEPIA数据库分析肿瘤组织和瘤旁正常组织进行LUCAT1表达差异;通过Diana Lncbase明确LUCAT1下游关键靶点分子miR-9-5p,Targetscan、microCDT和miRwalk多个数据库用来寻找miR-9-5p下游关键靶点分子CXCR4;STRING数据库用来分析CXCR4和CXCL12蛋白之间的互相作用;通过双荧光素酶报告实验验证LUCAT1与miR-9-5p的互作关系以及miR-9-5p与CXCR4的互作关系;生存分析和Cox分析评估LUCAT1及下游靶点分子表达量和胶质瘤患者总体生存率之间的关系;分析TISCH数据库的胶质瘤单细胞数据研究CXCR4和CXCL12蛋白在胶质瘤微环境所起到的作用。第二部分:体外细胞实验首先,研究LUCAT1及下游靶点miR-9-5p与胶质瘤生物学表型之间的关系;采用qRT-PCR和Western-blot实验检测胶质瘤沉默LUCAT1或促进miR-9-5p后CXCR4、CXCL12基因和蛋白质表达水平。其次,将人胶质瘤细胞株分为siLUCAT1 组、siNC 组、siLUCAT1+miR-NC 组、siLUCAT1+miR-9-5p inhibitor组。CCK-8实验检测转染后胶质瘤细胞的增殖水平;并通过研究胶质瘤分布胞凋亡情况分析LUCAT1和胶质瘤细胞分裂的情况。研究结果第一部分:生物信息学分析LUCAT1在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤（胶质母细胞瘤）组织中的表达水平均显著高于正常脑组织;Diana Lncbase明确LUCAT1下游关键靶点分子为miR-9-5p;Targetscan、microCDT和miRwalk数据库预测miR-9-5p下游关键靶点分子为CXCR4;STRING数据库分析CXCR4和CXCL12蛋白之间存在互相作用;双荧光素酶实验证明LUCAT1和miR-9-5p存在结合位点,并证明miR-9-5p和CXCR4存在结合位点;生存分析和Cox分析LUCAT1、miR-9-5p、CXCR4基因表达量和胶质瘤患者总体生存率相关;胶质瘤单细胞数据显示CXCR4和CXCL12蛋白在胶质瘤微环境作为细胞上的配体和受体参与细胞间通讯。第二部分:体外细胞实验沉默人类胶质瘤细胞中LUCAT1的表达后,胶质瘤中CXCR4、CXCL12的基因和蛋白表达水平显著下调,miR-9-5p的基因表达升高;促进人类胶质瘤细胞miR-9-5p后,CXCR4和CXCL12的基因和蛋白表达水平显著下降;说明沉默胶质瘤细胞LUCAT1的表达和促进miR-9-5p会影响下游CXCL12-CXCR4信号通路的蛋白的表达。siLUCAT1组（转染LUCAT1 siRNA组）胶质瘤细胞相比siNC组（转染NC siRNA组）胶质瘤细胞增殖水平显著降低,凋亡率均显著增高,说明沉默LUCAT1的表达能通过抑制胶质瘤细胞恶性增殖促进凋亡。siLUCAT1+miR-9-5p inhibitor 组（共转染 LUCAT1 siRNA+miR-9-5p 组）相比 siLUCAT1+miR-NC 组（共转染LUCAT1 siRNA和miR-NC组）胶质瘤细胞增殖水平显著升高,肿瘤细胞处于分裂期（S期）增多,肿瘤细胞凋亡率降低,说明LUCAT1能通过调控miR-9-5p参与胶质瘤细胞增殖与凋亡以及细胞周期的调控。结论1.LUCAT1与胶质瘤的恶性增殖正相关,LUCAT1的表达水平高和患者的总体生存率负相关,并有望成为胶质瘤预判胶质瘤患者预后的分子标志物。2.LUCAT1对miR-9-5p靶向负向调控作用,并通过miR-9-5p影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。3.miR-9-5p对CXCR4具有靶向负调控作用,LUCAT1沉默后通过上调miR-9-5p的水平,抑制促癌基因CXCR4的表达,参与肿瘤细胞的增殖和凋亡过程。