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牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea mucosal disease, BVD-MD)是流行范围广泛,危害严重的牛传染性疾病之一,该病由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起,可突破宿主特异性交叉感染其他反刍动物,很难得到有效控制,给养牛业造成巨大经济损失。BVDV感染会造成牛呼吸系统疾病、可增强牛对其他疫病的易感性,使牛奶产量下降、仔牛出生率降低。目前,对BVDV感染牛的处理方法多为主动免疫牛群、宰杀病牛或采用综合措施。BVDV是含一个开放阅读框(Open reading frame, ORF)的RNA病毒,可产生多种结构蛋白和非结构蛋白。RNA干扰将双链RNA (double-strands RNA, dsRNA)切割成若干可特异性沉默靶基因表达的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)。应用带有RNA酶polⅢ类启动子的质粒载体表达短发卡RNA (short-hairpin RNA, shRNA)可在细胞内产生激活的siRNA。本研究针对BVDV基因组保守回文序列设计了两个双寡核苷酸链shRNA,分别命名为sh1083和sh8235,退火后形成shRNA短发卡结构。将此片段插入已构建好的含有H1启动子和BglⅡ, HindⅢ酶切位点的pSGHl质粒载体,转化DH5a大肠杆菌,挑取阳性单克隆。将阳性单克隆扩大培养后,分别用PCR法、双酶切法及测序法进行鉴定,构建pSGH1-sh1083和pSGHl-sh8235重组shRNA质粒载体。通过脂质体转染法将重组shRNA载体转染到MDBK细胞,联用eGFP荧光蛋白标记和Neomycin抗性标记筛选细胞克隆,运用有限稀释法挑取细胞亚克隆,多次筛选最终构建稳定转染RNAi载体的subclonepSGH1-sh1083和subclonepSGHl-sh8235单克隆细胞系。在检测subclonepSGH1-sh1083和subclonepSGH1-sh8235单克隆细胞系对BVDV的复制的抑制作用时,观察不同细胞感染BVDV后72h的CPE,对照组细胞出现明显病变效应,而稳定表达干扰载体的细胞病变不明显；测定了BVDV在单克隆细胞系上表达的TCID50,结果显示BVDV感染稳定表达shRNA的单克隆细胞系的TCID50明显低于对照组；用RT-PCR扩增出不同细胞系的GAPDH管家基因、BVDV的E2基因以及不同细胞系感染BVDV后表达的E2基因,通过琼脂糖凝胶电泳图看出,相比对照组,稳定表达RNAi载体的单克隆细胞系感染BVDV后,E2基因的表达减弱或者几乎没有；流式细胞术检测不同细胞系接毒24h后BVDV的表达,从结果直方图分析中可看出,稳定表达干扰片段的单克隆细胞系与病毒结合百分率分别为11.37%和11.51%,与对照组20.25%相比有所降低。上述研究结果表明,本文成功获得了shRNA干扰的RNAi载体,建立了稳定转染RNAi载体的单克隆细胞系,该细胞系对BVDV的复制具有抑制作用。