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1目的通过对阳春砂转录组及表达谱数据深入研究,挖掘挥发性萜类合酶相关基因,并对其基因表达特性及功能进行研究,为深入认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控机制奠定基础,为推进阳春砂萜类活性成分的代谢工程调控及种质资源优化提供帮助。2方法通过对阳春砂果实不同成熟时期及MeJA诱导实验2个转录组数据中KEGG pathway注释情况进行筛选并统计,并结合阳春砂中含有的主要挥发性萜类成分及其在单萜、倍半萜类化合物生物合成途径中的相关酶基因,在NCBI中查找并下载龙脑基二磷酸合酶、蒎烯合酶、松油烯合酶等4个单萜合酶与双环大根香叶烯合酶等5个倍半萜合酶的其他物种中相应基因的蛋白序列,通过本地BLAST软件对阳春砂转录组数据进行blastp、tblastn比对再注释,获取更多候选unigene,再通过同源进化分析、转录组间关联比对等方法最终筛选出阳春砂挥发性萜类合酶候选基因(AvTPS)。对候选AvTPS基因进行开放阅读框(ORF)预测,并对含有全长ORF的AvTPS基因设计引物,扩增其编码区全长DNA,通过平末端连接的方法构建目的AvTPS基因的克隆载体；并通过生物信息学分析,推测这些基因的开放阅读框、编码氨基酸、编码蛋白分子质量、等电点、亲疏水性等理化性质,预测亚细胞定位及一二级结构,并通过与已知TPS的多序列比对及遗传进化分析推测其功能。通过绝对定量法对克隆所得AvTPS基因进行实时荧光定量PCR检测,分析其在阳春砂不同部位及不同成熟时期的表达水平变化；并通过MeJA诱导实验中AvTPS基因表达谱数据及挥发性萜类含量数据进行两两线性相关系数的计算,分析AvTPS基因与阳春砂挥发性萜类成分的相关性。3结果3.1阳春砂挥发性萜类合酶基因的挖掘本文从2个阳春砂转录组中共筛选获得挥发性萜类合成下游途径相关unigene 27个,包括转录组直接注释unigene 9个,本地blast再注释unigene18个；并结合与NCBIblastp所得相似序列的同源进化分析、转录组间unigene的序列相似性分析,最终选定11个阳春砂挥发性萜类合酶候选基因,重命名为AvTPS1～11。3.2 AvTPS编码区全长序列的克隆及其编码蛋白功能分析对有全长ORF的4个AvTPS编码区全长进行了克隆,AvTPS1包含1803bp的ORF,编码600个氨基酸；AvTPS3包含1791bp的ORF,编码597个氨基酸；AvTPS5包含888bp的ORF,编码295个氨基酸；AvTPS8包含1650bp的ORF,编码549个氨基酸；并成功构建其重组克隆载体pLB-AvTPS1、pLB-AvTPS3、pLB-AvTPS5和pLB-AvTPS8。除AvTPS5外,其他3个AvTPS预测蛋白分子量均在60-70kDa之间、等电点接近5.0、pH接近中性,与其他已知TPS相似；结构上也具有DDXXD等TPS特征功能域,与其他已知TPS也表现出较近的遗传距离,将AvTPS1和AvTPS3归类于单萜合酶,AvTPS8归类于倍半萜合酶。AvTPS5编码蛋白各性质则更接近于萜类环化下一阶段的脱氢还原酶。3.3 AvTPS基因的表达变化及相关性分析本研究对克隆所得4个AvTPS基因进行了qRT-qPCR表达水平检测,结果表明AvTPS1、AvTPS3和AvTPS8表现出显著的组织特异性,AvTPS1、AvTPS3和AvTPS5则表现出了生长发育阶段的表达特异性,符合萜类合酶表达与调控的时空差异的特点。进一步将各AvTPS的表达量数据与阳春砂挥发性萜类数据关联分析,证明大部分AvTPS均与阳春砂中的挥发性萜类化合物含量总量呈现出一定的相关性,AvTPS2、 AvTPS5、AvTPS7和AvTPS9表现出较一致的相关模式,AvTPS6和AvTPS11则往往表现出另一类相反的相关模式；且根据与具体萜类化合物含量的关联分析,在果皮中表达较高的AvTPS1、AvTPS2等及在种子团中表达较高的AvTPS3、AvTPS6等分别与不同部位的主要成分分别呈正相关,可能在这些物质的合成途径中起到一定作用。4结论结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂11个值得后续研究的萜类合酶基因；其中对部分AvTPS的克隆更为进一步的基因功能鉴定和应用于阳春砂挥发性萜类代谢工程的研究奠定了基础。