论文部分内容阅读
第一部分：耳蜗器官体外培养技术的建立目的：建立稳定的新生小鼠耳蜗器官(Corti’s Organ)的体外培养方法以及耳蜗毛细胞(hair cells)的组织学检查技术,为内耳研究提供新的条件和模型。方法：在解剖显微镜下将出生后3-5天的小鼠基底膜完整的分离,用显微剪分成底回、中回和顶回三个节段,利用培养液的表面张力使基底膜节段贴培养皿底壁平铺培养。应用荧光标记的鬼笔环肽特异性染色标记耳蜗毛细胞的静纤毛和表皮板,荧光显微镜观察。结果：耳蜗器官经过24小时离体培养后,贴壁良好,外周可见明显新生的上皮细胞及成纤维细胞；经过2-4天的离体培养后,外周新生细胞继续增加,荧光显微镜观察显示毛细胞形态良好,纤毛排列整齐,成倒“V”字形。三排外毛细胞(OHC)和一排内毛细胞(IHC)无缺失。表皮板连接紧密。内毛细胞每100微米纵向长度细胞个数为顶回8.92±0.665；中回10.67±0.606；底回11.58±0.585。外毛细胞每100微米纵向长度细胞个数为顶回32.42±1.429；中回36.00±1.414；底回45.25±1.725。结论：组织贴壁法体外培养小鼠耳蜗器官是一种理想的观察和评估耳蜗毛细胞的实验造模方法。第二部分：17-DMAG及硫酸卡那霉素分别对体外培养的耳蜗毛细胞的作用目的：研究抗炎及抗肿瘤药物格尔德霉素的衍生物17-DMAG (17-(Dimeth y laminoethy lamino)-17-demethoxygeldanamycin)及硫酸卡那霉素两种药物对体外培养的耳蜗毛细胞的作用。方法：体外培养新生小鼠耳蜗器官24小时后加入不同剂量的上述两种药物,继续培养24小时后,组织固定。用荧光标记的鬼笔环肽特异性染色标记耳蜗毛细胞的静纤毛,荧光显微镜观察。计数存活的毛细胞个数。结果：0.5μM,1μM,2μM及5μM浓度的17-DMAG对耳蜗毛细胞均没有明显的毒性作用。0.2mM,0.4mM,和1.0mM的卡那霉素对毛细胞均有不同程度的损伤,随着卡那霉素浓度升高,毛细胞的损伤逐渐增加。外毛细胞的损伤程度大于内毛细胞。底回毛细胞损伤最严重,中回次之,顶回毛细胞损伤较轻。结论：本实验利用体外培养的耳蜗器官研究上述两种物质分别对耳蜗毛细胞的作用,易于精确控制剂量,简单明确。本实验排除了17-DMAG对耳蜗毛细胞的毒性作用。且对进一步研究毛细胞的保护作用提供了药物剂量。第三部分：17-DMAG诱导体外培养的耳蜗毛细胞过表达HSP70蛋白并保护卡那霉素引起的毛细胞损伤目的：研究17-DMAG在体外培养的耳蜗毛细胞是否可以诱导HSP70过表达并保护卡那霉素引起的耳蜗毛细胞损伤。方法：选取2μM17-DMAG浓度,分为给药组和空白对照组。利用漂浮培养法获得足够量的基底膜组织。利用实时定量PCR法和ELISA法检测2.5小时、5小时、10小时,以及24小时后HSP70在核酸和蛋白水平的表达量。利用荧光免疫组织化学法检测HSP70在基底膜的表达部位。选取2μM17-DMAG浓度和0.4mM卡那霉素浓度。分为空白对照组,卡那霉素组,和17-DMAG+卡那霉素组。利用鬼笔环肽特异性染色标记耳蜗毛细胞的静纤毛,荧光显微镜观察。计数存活的毛细胞数量。结果：17-DMAG在体外培养的耳蜗毛细胞可以诱导HSP70过表达,蛋白质水平的表达增加晚于核酸水平,但维持时间更长。且HSP70主要表达于内、外毛细胞的胞浆内。体外培养的耳蜗器官经过17-DMAG预处理5小时,再加入耳毒性卡那霉素,内、外毛细胞存活量均显著增加。17-DMAG能够保护卡那霉素对毛细胞的损伤作用。结论：17-DMAG在体外培养的毛细胞可以诱导热休克蛋白70的过表达,并且显著保护卡那霉素引起的毛细胞损伤。17-DMAG有潜力成为安全、有效的抗耳毒性药物。