植物源药物在疾病治疗方面发挥着越来越重要的作用,并且有着来源广泛、副作用小和成本低的优势。目前,植物源药物活性成分的分离纯化主要基于柱色谱技术,该技术存在运行压力高、耗时长、分离过程常使用大量有机溶剂等问题。这些问题的存在,不利于植物源药物的进一步开发利用。膜色谱是一项将膜分离技术和液相色谱技术相结合的新型分离技术,其分离过程主要依赖液相中不同溶质与分离膜之间相互作用强度的差异。因膜色谱分离方法具有运行压力低、分离速度快、易规模化等优点而备受关注。目前膜色谱技术主要应用于生物大分子,如蛋白、DNA和抗体的分离纯化,而在植物源药物成分纯化方面鲜有报道。本研究将膜色谱分离方法应用于植物源药物的分离纯化。与生物大分子不同,植物源药物一般分子量小、分子所带电荷少,与分离膜之间静电相互作用、疏水相互作用力等都较弱,这些特点使得药物分子不容易被分离膜吸附,难以实现色谱分离过程。因此强化膜对植物源药物提取液中不同成分的相互作用并维持这种相互作用的差异性是膜色谱技术应用于植物源药物分离纯化需要解决的关键问题。氧化石墨烯(GO)具有独特的二维平面结构、巨大的表面积、离域大π键结构,这些特点使其成为理想的吸附材料。迄今已有诸多研究报道将功能化GO用作低水溶性癌症治疗药物的载体,为解决此类药物给药难题提供了新的思路。在GO负载抗癌药物时,药物分子与GO之间通过疏水相互作用和π-π共扼作用(Hydrophobic interaction and π-π interaction)形成强有力的物理结合,从而实现高载药量和缓释功能。受此启发,本研究将GO偶联到膜基材上作为疏水相互作用位点,强化分离膜对植物源药物提取液中相关成分的吸附性能,为色谱分离创造先决条件。为此,制备了 GO改性的棉纤维(GO-CF),将其制成疏水相互作用分离膜,研究该分离膜的性能并应用于多酚、鞣花酸(EA)和丹参素(DSS)等植物源药物色谱分离纯化,从而为植物源药物的分离纯化建立一种运行压力低、快速,而且不使用有机溶剂、安全环保的疏水相互作用膜色谱(HIMC)方法。主要内容如下:1.氧化石墨烯改性棉纤维分离膜的制备与表征以棉纤维(CF)为基材,将GO以共价键的方式接枝到棉纤维上,提供强疏水吸附位点,将GO改性棉纤维制成片状分离膜。SEM、Raman、FT-IR和XPS测试表明,GO通过环氧开环反应接枝到CF上。以石榴皮粗提液中多酚的纯化为考察对象,研究了膜的基本性能。所得结果表明,跨膜压降会随着流速的增加而增加,但其膜压降(40～160kPa,0.5～5.0ml.·min-1)显著低于经典的商用色谱柱,表明本研究的色谱膜运行过程更节能;经多次吸附-脱附循环,跨膜压降未发生显著变化,说明分离膜具有良好的可重复使用性。对于石榴皮多酚的纯化,纯水和0.04M NaOH水溶液分别适宜作为吸附阶段和洗脱阶段的流动相。多酚主要通过疏水相互作用吸附到膜上,增强流动相溶液的碱性,导致多酚分子中的酚羟基解离、水合作用增强,减弱了多酚分子与膜之间的疏水相互作用,从而实现脱附。基于峰面积比(Elution peak/flow-throughpeak)计算结果,GO改性棉纤维膜对多酚的吸附量约是未改性棉纤维膜的140倍,证实了 GO改性对提升棉纤维基色谱膜性能的显著效果。经过一次吸附-脱附循环,可除去石榴皮提取液中约72.5%的多糖和几乎所有的蛋白,而多酚含量从48.0%提高到约76.1%,多酚回收率达73.0%左右。2.药物在膜色谱中相对保留时间估算方法的建立由于生物大分子和小分子药物在分子量、分子结构、电荷密度等方面的显著差异,现有描述生物大分子与色谱膜之间疏水相互作用的理论无法有效预测药物分子在疏水色谱膜上的保留行为。针对这一问题,本研究选择亲疏水性有显著差异的一系列药物作为模型化合物,研究其在反相高效液相色谱(HPLC)模式下的相对保留时间(tRR)与模型化合物亲水基团比率(HGR)之间的关系,建立了经验模型(tRR=1.06-0.52HGR-1.16(HGR)2,R2=0.96,水/乙腈流动相)。并且,考查了洗脱梯度和有机溶剂的种类对tRR的影响。结果表明,tRR与洗脱梯度陡度无关而与流动相有机溶剂的种类有关,极性大的有机溶剂对应更长的相对保留时间。根据目标药物的结构计算其HGR,可判断目标药物的相对亲疏水性,并计算其tRR,据此推断其在HIMC的相对保留时间顺序,从而快速确定收集目标药物成分的适宜时机,并为设计色谱膜分离运行方案提供指导。3.疏水相互作用膜色谱提纯鞣花酸和丹参素为克服目前用于鞣花酸和丹参素分离纯化的柱色谱法所存在的运行压力高、分离速度慢和使用大量有机溶剂的缺点,本研究采用所制备的GO-CF疏水色谱膜对EA粗品和DSS粗品进行纯化,考察了适宜的HIMC运行模式和运行条件。基于对相对保留时间tRR的估算,对于疏水性较强的EA,提出并实施了为吸附-脱附(Binding-elution mode)运行模式,即:杂质透过分离膜,而在洗脱阶段收集目标组分;对于亲水性的DSS,采用直接透过(Flowthrough)运行模式,即在吸附阶段收集目标组分,而杂质在洗脱阶段排出膜组件。系统考察了流动相溶液组成、pH、流速等因素对药物纯化效果的影响,所得结果表明:5mMNa2CO3溶液和0.04M～0.06M NaOH溶液分别适宜作为EA粗品分离纯化的吸附相溶液和洗脱相溶液,对于GO接枝量为0.4wt.%的改性棉纤维膜,经一次吸附-脱附循环,EA纯度从7.5%(原始提取液)提高到75.0～80.0%,该分离膜对EA的吸附量达到397.8μg·ml-1(根据膜体积),换算成GO的吸附量为GO吸附了自身质量27.5%的EA,与文献报道的功能化GO作为药物载体时对药物的吸附载药量相近。综合考虑DSS的稳定性和经济性,5mMpH6的磷酸钠缓冲溶液和0.04M NaOH溶液分别适合作为DSS粗品纯化的吸附相溶液和洗脱相溶液。通过一次吸附-脱附循环,DSS的纯度由24.8%(原始提取液)提高到70.0～75.0%,此纯度高于文献报道的吸附树脂柱色谱法(57.3%)和离子交换树脂柱色谱法(71.1%),而且DSS的回收率可达96.0%。对于DSS粗品的纯化是通过分离膜吸附杂质实现目标成分与杂质的分离,该过程的实现使疏水膜色谱分离纯化技术延伸到亲水药物成分的纯化,拓展了 HIMC的应用。