论文部分内容阅读
目的：探讨女性原发乳腺癌患者体内吲哚胺2,3双加氧酶（IDO／INDO）的表达与局部组织中浸润的调节性T细胞（Tregs）之间的联系，并建立稳定表达IDO的CHO细胞株，考察体外IDO对Tregs细胞发生、发育以及凋亡的影响。方法：选取2007年6月-2007年8月天津医科大学附属肿瘤医院手术治疗女性原发乳腺癌20例，RT-PCR检测IDO在乳腺原发癌组织、癌旁乳腺组织及腋窝引流区淋巴结中的表达，并将上述组织制作为单细胞悬液，流式细胞仪检测组织中浸润的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的比例，分析IDO表达对局部浸润Tregs细胞的影响，免疫组织化学法检测组织中CD4、IDO及Foxp3表达，进一步观察在乳腺癌患者中IDO与Tregs细胞的相互联系。调取INDO基因编码序列（CDS）区域，克隆至pMD19-T simple载体中并测序后连入真核表达载体pIRES2-EGFP。将IDO真核表达载体plRES2-EGFP-IDO转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，建立稳定表达IDO的CHO细胞株，PCR及RT-PCR检测INDO基因的整合与转录，Westernblot检测IDO蛋白的表达，氨基酸分析仪检测IDO蛋白的活性。分选并纯化人乳腺癌患者外周血CD3+T细胞，将其与转染IDO的CHO细胞共孵育，以转染空质粒组为对照。Annexin V-FITC和PI双染色流式细胞法检测T细胞的凋亡。流式细胞法检测CD4+CD25+CD127-调节性T细胞比例变化，半定量及实时荧光定量RT-PCR检测共培养后Foxp3基因表达变化，Western blot检测Foxp3蛋白表达。结果：半定量RT-PCR结果显示，乳腺癌患者腋窝引流区淋巴结组织中IDO表达水平高于乳腺原发癌组织，癌旁乳腺组织中IDO表达量最低，有统计学意义（P<0．05）。淋巴结、原发癌和癌旁乳腺组织中浸润的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞比例分别为（4．40±2．91）％、（2．62±2．14）％、（2．01±1．49）％，淋巴结组织中浸润的Tregs细胞比例最高，有统计学差异（P<0．05）。免疫组织化学法检测组织中IDO表达阳性细胞指数与Foxp3表达阳性细胞指数之间呈现线性相关（P<0．05）。IDO真核表达载体经酶切鉴定表明片段插入到载体pIRES2-EGFP中，证实质粒连接成功。稳定表达INDO基因的CHO细胞具有外源目的基因的整合和相应mRNA的转录，Western blot检测示其高表达IDO蛋白，氨基酸分析显示该蛋白可降解培养上清中的色氨酸，产生犬尿氨酸，具有功能活性。乳腺癌患者外周血CD3+T细胞与稳定表达IDO的CHO细胞共孵育72小时后，出现了明显的细胞凋亡，凋亡率为（79．07±8．13）％，而pIRES2-EGFP转染组和正常CD3+T细胞组的凋亡率分别为（59．8±11．46）％和（32．40±6．40）％，组间比较有统计学差异（P<0．05）。共孵育7天后，IDO转染CHO细胞组中CD4+CD25+CD127-T细胞占CD4+T细胞的比例为（8．98±1．88）％，而pIRES2-EGFP转染组为（3．73±1．12）％，两组之间有统计学差异（P<0．05）；半定量RT-PCR结果示前者Foxp3的表达明显高于后者，实时荧光定量RT-PCR结果亦显示前者Foxp3的相对表达量高于后者（0．00056±0．00012比0．00023±0．00005），IDO转染CHO细胞组Foxp3蛋白／β-actin的比值为（0．0450±0．0025），结果显示实验组Foxp3 mRNA的转录及蛋白的表达均高于对照组，具有统计学差异（P<0．05）。结论：第一，IDO的抑制作用与Tregs细胞在乳腺癌患者体内存在着密切联系，局部组织中IDO的高表达常同时伴有Tregs细胞的浸润。第二，成功构建了IDO的真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO，并建立了稳定表达IDO的CHO细胞株，IDO的活性表达可导致微环境中色氨酸耗竭，并产生其分解代谢产物，如犬尿氨酸等衍生物。第三，发现IDO影响了T细胞的增殖过程，并诱导了T细胞凋亡。证明IDO介导的肿瘤诱导免疫耐受机制中至少包括IDO活性表达导致的T细胞凋亡过程。第四，证实IDO可以在体外诱导Tregs细胞的生成。表明IDO能促进CD3+T细胞中具有分化潜能的细胞向Tregs细胞发生分化。IDO诱导的Tregs细胞的发生发育过程联合参与了IDO参与的众多免疫耐受反应。总之，本研究探讨了IDO和Tregs细胞在体内外的相互联系与作用。结果表明，IDO与Tregs细胞在肿瘤患者体内联系密切。体外实验表明IDO参与肿瘤免疫耐受的机制应包括IDO介导的色氨酸耗竭及其代谢产物的毒性作用、致T细胞凋亡作用和通过影响Tregs细胞的发生发育而诱导其生成三个方面。