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肠道微生态可以说是最复杂的生态系统,具有物种特异性以及时间空间的多样性,对宿主具有重要的作用。外在的环境因素和内在的宿主因素均对肠道内微生物菌群的定植产生巨大的影响。但是由于肠道微生物存在的环境特殊,直接获得其样本并对其结构和功能进行研究仍存在技术的盲点。本研究利用肠道微生物的体外装置对人和鸡肠道微生物的菌群结构和代谢、免疫功能进行了研究,并探讨了外界因素包括饮食和营养、药物、病原菌等对其结构和功能的影响,旨在为有效调控肠道菌群提供一定的理论依据。
本研究首先在本实验室内建立了一个工作体积为330ml的肠道微生物的体外装置,利用高通量的454测序技术对两次重复性实验所得到的菌群结构进行了分析,结果表明两次结果在属的水平上相似性可以达到95%左右,由此说明该装置具有良好的稳定性和可靠性。在此基础上,我们利用PCR-DGGE,qPCR和高通量的454测序技术在不同培养基的条件下比较分析了人和鸡的肠道微生物的菌群组成,并深入研究了不同物种的肠道菌群的代谢功能的差异性。结果表明,人和鸡肠道菌群显著不同,除了与人的肠道菌群共有的拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和梭菌门,鸡的盲肠菌群中还存在2个优势菌门,即放线菌门和TM7。菌群结构的差异决定了其功能的不同,鸡的肠道菌群适合在富含寡糖和肽的培养基(VL)中生长,而人的肠道菌群则更适合于多糖和蛋白质丰富的培养条件(VI);而且体外培养条件下,鸡的肠道菌群比人的肠道菌群产生了更多的挥发性脂肪。在VI和VL培养基中,鸡肠道菌群分别产生了76.63mM和75.74mM的挥发性脂肪酸,而人的肠道菌群只产生了63.58mM和48.44mM的挥发性脂肪酸。另外,该装置对人的肠道菌群具有很好的模拟性,特别是在VI培养基的条件下,得到的体外培养产物与原始的肠道菌群的相似性达到了67%。
为进一步研究外界因素对肠道微生物菌群结构和功能的影响作用,我们在该装置中引入了抗生素和病原菌等不同因素。一方面,我们利用肠道微生物的体外装置,评估了四环素和环丙沙星两类抗生素对人体肠道微生物菌群结构的影响。PCR-DGGE结果表明,四环素和环丙沙星可以显著降低人体肠道菌群的多样性,并改变了肠道菌群的结构。16S rDNA文库和454焦磷酸测序结果表明,在这两种抗生素的作用下,人体肠道菌群的主要菌门-拟杆菌门和厚壁菌门的数量大幅下降,而变形菌门以及互养菌门的细菌量则大幅增加。另一方面,我们也利用该装置研究了在体外通过改变不同的培养基来调节鸡的肠道菌群,进而调节其对沙门氏菌抵抗能力。PCR-DGGE和实时定量PCR的结果表明,VL培养基中所得的拟杆菌丰富的菌群结构与鸡起始的菌群结构更相似。VI培养基能够有利于富集益生菌-双歧杆菌和乳酸菌,能产生相对较多的乙酸和丙酸,因此,接种沙门氏菌7天内,沙门氏菌的数量在VI培养基中显著下降。随后在VI培养物中分离了3株乳酸菌,并对其抑菌活性进行了分析,发现这3株菌均呈现了对沙门氏菌较好的抑菌能力,且该抑菌性是不依赖于乳酸的。
综述所述,体外连续培养系统是一个具有很好的重复性的可靠的肠道微生物的体外装置,利用该装置不仅可以认识动物肠道的菌群结构,还可以研究这些菌群的代谢能力和抵制病原菌等的作用,为进一步了解肠道菌群的功能提供了一定的技术手段。