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氧化还原酶作为一种生物催化剂,可催化底物特异性氧化还原,具有反应速率快、反应条件较温和等优势,在临床医药、环境治理、工业生产、生物合成及检测等领域具有广泛的市场前景。碳纳米材料具有生物相容性、机械抗性强和比表面积大等优势,使其成为固定化氧化还原酶的优良载体。本文主要研究功能碳材料固定化氨基酸脱氢酶,提高酶在高温和有机溶剂下的抗逆性能。主要内容包括:1.对来源于海洋菌株的新型耐盐耐热氨基酸脱氢酶（Amino acid Dehydrogenase,AaDH）的酶学性质及催化动力学进行研究,并考察其盐激活性能和有机溶剂耐受性。对于氧化脱氨体系,反应的最适温度为60℃,最适pH为12。可适应如此高pH的AaDH鲜有报道。在含有30%（体积比）有机溶剂的Gly-NaOH缓冲液体系中,如甲基叔丁基醚、环己烷和二甲亚砜,AaDH的催化活性分别是不含有机溶剂体系的113.7%、111.7%和120.6%。对于还原胺化制备L-高苯丙氨酸的反应,反应的最适温度为70℃,最适pH为8.5。在含30%（体积比）有机溶剂的Gly-NaOH缓冲液体系中,如甲基叔丁基醚、环己烷和二甲亚砜体系中,AaDH的催化活性分别是原始的101.3%、47.3%和99.2%。利用圆二色谱分析酶的二级结构,有机溶剂下AaDH的二级结构受到影响。并在不同NaCl浓度下进行分子动力学模拟,分析结果与实验结果相吻合,证明1～3 M NaCl浓度可对酶活起到激活作用。2.构建金属离子配位聚多巴胺（Polydopamine,PDA）修饰多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotubes,MWNTs）作为新型固定化载体（MWNTs-PDA）。MWNTs-PDA-Ni,相对于MWNTs-PDA固定化酶,MWNTs-PDA-Ni的酶活回收为MWNTs-PDA的2倍。在7次重复利用后,MWNTs-PDA-Ni-AaDH和MWNTs-PDA-AaDH 剩余酶活为 58.0%和 47.1%。在 60℃ 下保温 3 h,MWNTs-PDA-Ni-AaDH 的相对酶活为 42.4%,而 MWNTs-PDA-AaDH 的相对酶活为36.4%。考察固定化酶在有机溶剂中的稳定性,在30%环己烷下MWNTs-PDA-Ni-AaDH 和 MWNTs-PDA-AaDH 比游离酶提高 2.0 和 3.2 倍。通过扫描电子显微镜研究固定化酶的微观形态,MWNTs-PDA-Ni-AaDH形状规则。研究固定化机理,发现载体MWNTs-PDA-Ni与AaDH存在多种弱相互作用力。3.利用聚乙烯亚胺（Polyethylenimine,PEI）接枝氧化石墨烯（graphene oxide,GO）得到 GO-PEI,固定化苯丙氨酸脱氢酶（Phenylananine Dehydrogenase,PheDH）。以金属离子对GO-PEI载体配位后进行酶的固定化。载体以金属配位、静电作用和氢键多种作用力与酶结合。比较不同固定化载体的酶活差异,GO-PheDH、GO-PEI-Mn-PheDH 和 GO-PEI-Mg-PheDH,相对酶活分别是 37.4%、73.3%和86.7%。GO-PEI-Mn-PheDH和GO-PEI-Mg-PheDH的Km值为 0.202 和 0.093,游离酶的Km值为0.528。固定化材料对底物有富集作用,因此底物亲和力提高。GO-PEI-Mn-PheDH和GO-PEI-Mg-PheDH在pH 5-12反应条件下相对酶活均比游离酶高。通过扫描电子显微镜研究固定化酶的微观形貌,研究固定化机理。4.利用还原氧化石墨烯（Reduce graphene oxide,CRGO）进行苯丙氨酸脱氢酶固定化。海洋菌株来源的PheDH是嗜盐酶,2 M NaCl下的酶活性较0 M提高20.1%。考察用抗坏血酸不同还原时间获得的不同还原程度的CRGO固定化性能。还原12 h的CRGO固定PheDH的酶活回收率最高,为46.4%。考察NaCl浓度对12h-CRGO-PheDH的酶活回收率的影响,4 M NaCl下酶活回收率为0M NaCl的1.8倍。增加NaCl浓度可加强酶与GRGO的疏水相互作用,提高固定化率。温度稳定性研究发现40℃下保温3 h,4 M NaCl下的12h-CRGO-PheDH比0 M NaCl 的 12h-CRGO-PheDH 提高 18.5%。12h-CRGO-PheDH 在 0 M NaCl 下4次重复利用后剩余酶活仅为15.3%,在4 M NaCl下4次重复利用后相对酶活可保持62.7%。证实NaCl可以大幅度提高固定化酶的稳定性。5.考察金属配位载体CRCO-Mn原位固定化PheDH的性能。将载体加入从粗酶液直接进行固定化,发现载体对酶具有很好的特异性固定化,可获得80%的酶活回收,酶负载量为6.7 mg/mg;原位与非原位固定化法对PheDH负载量随蛋白浓度提高增长趋势相似。CRCO-PEI和CRCO-Mn-PEI对PheDH负载量降低,提高NaCl浓度后负载量有所提高,在1 M NaCl下分别提高10.7%和30.6%。原位固定化方法无需分离纯化,可提高酶活回收,并节省操作时间,降低成本。