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背景与目的 基因突变的逐渐积累，使原癌基因或抑癌基因的调控发生了改变，破坏细胞增殖的正常规则，导致肿瘤发生。细胞增殖通过一系列调节细胞周期进程的调控因子介导，最关键的细胞周期检验点是G1／S。p16基因是一种细胞周期素依赖性激酶（CDK）抑制因子，编码的蛋白可与细胞周期素D（cyclin D）竞争性结合CDK4、6，抑制pRB蛋白磷酸化而使细胞周期停止于G1期。p16基因的失活，导致pRB蛋白功能受抑制，进而使细胞增殖加快。p16是最重要的抑癌基因之一，除了缺失、突变可导致其失活外，DNA甲基化——这种表遗传学上的改变，也起到了相当重要的作用。有报道乳腺癌p16基因高甲基化是其mRNA和蛋白表达下调的主要原因。甲基化发生的过程是：DNA胞嘧啶-5甲基转移酶（DNMT）将S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基基团转移到高等真核生物基因组DNA的CpG岛上胞嘧啶的C5原子上。5-azacytidine（5-aza-CR）和5-aza-2’一deoxycytidine（decitabine）是研究的最多的两种去甲基化药物，它们与胞嘧啶结构相似，可与DNA甲基化转移酶（DNMT1）共价结合使酶失活；也可整合入DNA中，从而达到去甲基化的目的。这两种药物作用很强但是有细胞毒和致突变作用，因此寻找其它安全有效的去甲基化剂具有重要意义。本研究通过中药成分CDP与5-aza-CR对比作用研究，检测细胞增贿变化，细胞周期改变以及p16甲基化程度的改变，四川大学硕士学位论式作者徐丹导师草扬教授观察其对细胞生长以及诱导P16基因重新表达的影响，探索CDP逆转抑癌基因高甲基化、抑制肿瘤细胞生长的机理，为进一步应用于肿瘤治疗提供初步的实验依据。方法不同浓度的5一aza一CR或CDP处理T47D细胞数天，细胞增殖试验 （M竹法）检测对T47D细胞生长的影响;流式细胞术检测凋亡峰和细胞周期改变;提取基因组DNA，以甲基化特异性PCR（MSP）检测用药前后pl6基因5’CpG岛甲基化、非甲基化状态及程度的改变。结果5一aza一CR和CDP加药浓度依次递增时，细胞生存率依次递减，当5一aza一CR浓度增力「I到5卜tmolzL和CoP增)JI一到250卜Lmo一几11寸，可见细胞大部分死亡;在细胞生长平稳期（第5天），随两种药物浓度递增，细胞生长抑制率也渐次增大，半数最大抑制浓度5一aza一cR:Ic50==l .79林mol几，cDP:Icso二45.38林mol几。M竹测定的抑制细胞生长的最适药物浓度5一 aza一eR（2卜mol几）和eDP（50林mol几）处理细胞三天后，流式细胞仪测定细胞周期和凋亡峰:与对照组比较，凋亡细胞比例改变不大;两种药处理后T47D细胞周期均发生改变，G了Gl期延长，G:期和S期则缩短。提取用药物处理前后细胞DNA并以pl6甲基化和非.甲基化特异引物进行甲基化特异性pCR（methylations讲eifie PeR）鉴定:未经药物处理的细胞仅甲基化引物扩增出特异PcR条带，5一aza一cR和CDP处理T47D细胞6天后，仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带。结论MTT法分析说明这两种药物对T47D细胞的生长有抑制作用，并有时间和浓度依赖性（P<0.05）;M了q，测定的抑制细胞生长的最适药物浓度5一aza一eR（2林mol几）和eDP（50林mo一儿）处理细胞三天后，这两种药物的浓度对细胞凋亡诱导作用不明显，但两种药物均使细胞生长阻断在G，期;药物处理前后对比P16基因甲基化状态，表明P16基因已被完全去甲基化。由此推论cDP可能通过逆转T47D细胞pl6基因高甲CDP抑制乳腺癌细胞T470生长及逆转p16基因甲基化的研究基化，使P16基因重新表达，抑制pRB蛋白磷酸化，导致细胞停滞于G，lS期，从而细胞增殖缓慢。 本研究为CDP可能经去甲基化作用抑制肿瘤细胞生长提供了初步的实验依据。关键词:cDPS一氮杂胞昔乳腺癌P16基因甲基化特异性PcR