自噬是细胞在炎性刺激或应激反应中的一种分解代谢过程,可降解受损细胞器,变性蛋白质和病原微生物等内源性或者外源性成分。自噬可介导细胞自身代谢和更新,参与感染、炎症、肿瘤等多种病理生理过程。炎症与自噬相互促进与制约,以维持免疫自稳:首先,感染介导的炎症可以通过PAMP对PRR的刺激与结合以启动自噬,通过自噬途径以清除胞内病原体。继而,被炎症刺激因素(PAMP)诱导启动的自噬,又可通过抑制炎性小体通路等机制,发挥负向调控/抑制炎症的功能,从而控制炎症反应。磷酸酰基醇3-激酶(PI3Ks)是生长因子调控信号通路中的重要分子,在炎症、增殖、分化、凋亡、糖代谢等方面发挥非常重要的作用。PI3K分为Class I(IA和IB)、II、III型,其中Class IA型PI3K是由催化亚基(p110α/β/δ)和调节亚基(p85α/β,p55α/γ,p50α)组成的异二聚体。文献报道,经典Class IA PI3K通路可通过mTORC1抑制自噬小体的生成,关于非经典的PI3K调节亚基p55γ(即p55PIK)对自噬的作用尚未报道。本实验室前期实验结果表明,在小鼠AOM-DSS肠炎模型中,p55PIK特异性抑制剂(TAT-N15)可缓解急性和慢性炎症期的炎性基本性状,可降低急性和慢性炎症期促炎细胞因子(TNF-α,IL-1b和IL-6)的表达,提示p55PIK可促进AOM-DSS肠炎模型的急性和慢性炎症反应。由此我们提出科学问题,p55PIK能否通过影响自噬而发挥其促炎效应?本研究选择适度表达p55PIK的巨噬细胞(骨髓来源的巨噬细胞BMDM和THP-1细胞系)作为研究对象。旨在探索p55PIK通过抑制自噬而促进LPS诱导的炎症效应,主要结果如下:一.研究对象的选择:BMDM和人THP-1细胞系来源的巨噬细胞以BIOGPS和GeneCards网站信息提示,通过western blot检测p55PIK在小鼠Th1,Th2,Th17和Treg等不同亚群和人单核细胞系中的蛋白表达结果。选择骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和THP-1细胞系作为本课题的研究对象。二.p55PIK可促进LPS诱导的炎症反应2.1 p55PIK特异性抑制剂TAT-N15可抑制LPS诱导的炎症在诱导成熟的骨髓来源巨噬细胞BMDM和THP-1细胞系中预先加入p55PIK特异性抑制剂TAT-N15处理12小时,再用LPS刺激4h,分别收集细胞总RNA和细胞培养基上清,Real Time-PCR和ELISA分别检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)和抑炎细胞因子(TGF-β和IL-10)的mRNA和蛋白水平。结果显示,在BMDM和THP-1中,TAT-N15能显著抑制LPS诱导的促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)mRNA和蛋白水平,而TAT-N15对LPS诱导的抑炎细胞因子(TGF-b和IL-10)mRNA和蛋白水平表达无影响。该结果提示:p55PIK特异性抑制剂TAT-N15可抑制LPS诱导的炎症。2.2在THP-1细胞系中,低表达p55PIK可抑制LPS诱导的炎症首先通过CRISPR-Cas9技术,设计sgRNA,以慢病毒包装质粒转染293T,慢病毒感染THP-1细胞系,成功筛选低表达p55PIK稳转细胞系。用LPS刺激THP-1低表达p55PIK稳转细胞系(p55PIK-KO)4h,分别收集细胞总RNA和细胞培养基上清,以Real Time-PCR和ELISA检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)和抑炎细胞因子(TGF-b和IL-10)的mRNA和蛋白水平。结果显示,与对照细胞系相比,在稳定低表达p55PIK的THP-1细胞系(p55PIK-KO)中,LPS诱导的促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)mRNA水平和蛋白表达受到明显抑制,而抑炎细胞因子(TGF-b和IL-10)的mRNA和蛋白表达无明显变化。该结果提示:低表达p55PIK可抑制LPS诱导的炎症。2.3在THP-1细胞系中,高表达p55PIK可促进LPS诱导的炎症通过高表达p55PIK慢病毒转染THP-1细胞系,成功筛选高表达p55PIK稳转细胞系(p55PIK-OE)。同样用LPS刺激4h,分别收集细胞总RNA和细胞培养基上清,Real Time-PCR和ELISA分别检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)和抑炎细胞因子(TGF-β和IL-10)的mRNA和蛋白水平。结果显示,在THP-1细胞系中,高表达p55PIK可显著促进LPS诱导的促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的mRNA和蛋白水平,对抑炎细胞因子(TGF-b和IL-10)的mRNA水平和蛋白水平无明显抑制。该结果提示:高表达p55PIK可促进LPS诱导的炎症。2.4在巨噬细胞中,p55PIK可促进LPS-NF-kB信号通路中p65活化2.4.1在LPS刺激的THP-1细胞中,p55PIK的表达被上调,且p65活化在THP-1中,用LPS分别刺激不同时间点(0h,2h,4h),以western blot检测p55PIK和p-p65。结果显示:与对照组相比,随着LPS作用时间增加,p55PIK蛋白表达和p65磷酸化逐渐升高。该结果提示,在LPS刺激的THP-1细胞中,p55PIK可激活NF-kB信号通路。2.4.2在LPS刺激的BMDM细胞中,TAT-N15可抑制LPS-NF-kB信号通路中p65活化将BMDM用TAT-N15预处理12h,再用LPS刺激激不同时间点(0h,2h,4h,6h),以western blot检测p-Akt(S473)和p-p65。结果显示:在LPS不同刺激时间点,TAT-N15可明显抑制p-p65,而对p-Akt(S473)表达无明显作用。该结果提示:在LPS刺激的BMDM中,TAT-N15以Akt非依赖形式抑制p65的活化。三.在LPS刺激的巨噬细胞中,p55PIK可抑制自噬3.1在BMDM中,p55PIK特异性抑制剂TAT-N15可促进自噬以自噬抑制剂BafA和TAT-N15单独或者同时处理BMDM,以Western blot检测自噬重要标志物LC3和p62的蛋白表达。结果显示,与BafA单独组相比,随着TAT-N15作用的时间增加,自噬相关标志蛋白LC3和p62的表达同时升高。RFP-GFP-LC3双荧光共聚焦结果显示,与CP和对照组相比,TAT-N15组中LC3红色和绿色融合的双荧光---黄色荧光聚集颗粒明显增多,提示TAT-N15可能促进BMDM胞内自噬小体形成。另外,TAT-N15组与CP和对照组相比,LC3单独红色荧光聚集颗粒也明显增多,提示TAT-N15可能促进BMDM中自噬流。3.2在LPS刺激的THP-1细胞系,低表达p55PIK可促进自噬在对照细胞系和低表达p55PIK的THP-1细胞系中,以LPS预刺激8h,再用BafA处理4h,以Western blot检测LC3表达。结果显示,与对照细胞系相比,p55PIK低表达稳转细胞系中,LC3表达量明显上升,提示低表达p55PIK可能促进自噬小体的形成。以RFP-GFP-LC3慢病毒转染上述细胞系,进行RFP-GFP-LC3双荧光共聚焦检测:和对照细胞系相比,p55PIK-KO组中,LC3单独红色荧光聚集颗粒明显增加,提示低表达p55PIK可促进自噬流的发生。上述结果初步提示,在LPS刺激的THP-1细胞系中,低表达p55PIK可促进自噬。3.3在LPS刺激的THP-1细胞系,高表达p55PIK可抑制自噬在对照细胞系和高表达p55PIK THP-1细胞系中,以LPS预刺激8h,再用Rapamycin处理4h,Western blot检测LC3蛋白表达。结果显示,与对照细胞系相比,p55PIK高表达组细胞中LC3表达量明显下调。以RFP-GFP-LC3双荧光共聚焦检测自噬的变化,高表达p55PIK后,LC3红色单荧光聚集颗粒明显减少,该结果提示在LPS作用下,THP-1细胞高表达p55PIK时,自噬流的发生被抑制。上述结果提示,在LPS刺激的THP-1细胞系中,高表达p55PIK可抑制自噬。四.在巨噬细胞中,p55PIK可通过抑制自噬而促进LPS诱导的炎症4.1在THP-1中,自噬可抑制LPS介导的炎症分别用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin预处理THP-1细胞1h,再用LPS刺激4h,收集细胞总RNA和培养基上清。Real Time-PCR和ELISA分别检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的mRNA和蛋白水平。结果显示在抑制细胞自噬情况下,细胞因子IL-1β的mRNA和蛋白水平明显增多;在促进细胞自噬情况下,细胞因子IL-1β的mRNA和蛋白水平明显减少。该结果提示在THP-1中,自噬可负向调控炎症。4.2在低表达p55PIK的THP-1稳转细胞系中,抑制自噬可部分逆转低表达p55PIK下调IL-1β表达的作用在低表达p55PIK的THP-1稳转细胞系中,预先加入自噬抑制剂3-MA处理1h,再用LPS刺激4h,收集细胞总RNA和培养基上清。Real Time-PCR和ELISA分别检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的mRNA和蛋白水平。结果显示,在LPS作用下,低表达p55PIK可促进自噬,且抑制促炎细胞因子的mRNA水平和蛋白表达,但是将低表达p55PIK稳转细胞系经自噬抑制剂3-MA处理后,亦即阻断其促进自噬的效应后,其抑制IL-1β分泌的作用也随之被部分逆转,对TNF-α和IL-6的抑制作用则没有逆转效果。该结果提示在低表达p55PIK的THP-1稳转细胞系中,抑制自噬可部分逆转低表达p55PIK下调IL-1β表达的作用。4.3在p55PIK高表达的THP-1稳转细胞系中,激活自噬可部分逆转p55PIK上调IL-1β表达的作用在高表达p55PIK的THP-1稳转细胞系中,预先加入自噬诱导Rapamycin处理1h,再用LPS刺激4h,收集细胞总RNA和培养基上清。Real Time-PCR和ELISA分别检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的mRNA和蛋白水平。结果显示,在LPS作用下,高表达p55PIK可抑制自噬,且促进促炎细胞因子的mRNA水平和蛋白表达,但是将高表达p55PIK稳转细胞系经自噬诱导剂Rapa处理后,亦即反转其抑制自噬的效应后,其促进IL-1β和IL-6分泌的作用也随之被部分逆转,对TNF-α分泌的促进作用则无逆转效果。该结果提示在p55PIK高表达的THP-1稳转细胞系中,激活自噬可部分逆转p55PIK上调IL-1β表达的作用。本课题验证p55PIK对巨噬细胞这一固有免疫细胞的促炎效应,阐明p55PIK和p55PIK特异性抑制剂TAT-N15对固有免疫应答的促进/抑制作用及其机制。首次揭示p55PIK通过抑制自噬而促进LPS诱导的炎症这一生物学效应,该研究不仅丰富Class IA型PI3K非经典调节亚基p55PIK抑制自噬的作用,而且为p55PIK特异性抑制剂TAT-N15在LPS诱导炎症性疾病中的治疗作用提供理论依据,为防治LPS所致内毒素休克等感染性疾病提供新的靶点和治疗手段。