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背景：端粒酶是近年来研究细胞恶性增殖与衰老机理的热点之一。一方面，端粒酶的高活性是肿瘤细胞无限增殖的重要原因之一，另一方面，端粒酶又具有延长细胞寿命的作用。有研究表明，在已知端粒酶的三个亚单位中，只有端粒酶蛋白催化亚单位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)与端粒酶活性相一致，是端粒酶重要的限速成分。在没有端粒酶活性的体细胞中异位表达hTERT，可以使细胞寿命明显延长。已有报道hTERT转染的体细胞可以作为组织工程的种子细胞。成纤维细胞作为真皮的主要成分，在组织工程中具有重要意义，因此，我们用hTERT基因转染人胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast, hEF)，初步研究其对生物学特性的影响并初步探讨将转染hTERT基因的hEF培养成为种子细胞的可能性。目的：构建hTERT基因荧光真核表达载体并导入人胚胎成纤维细胞中，探讨外源性hTERT基因转染对hEF细胞生物学行为的影响。方法：用基因工程的方法将hTERT全长 cDNA构建到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中，经酶切鉴定后用阳离子脂质体Lipofectin将正义重组质粒及空载质粒转染入hEF，G418筛选；通过PCR、RT-PCR和Western blot从DNA、mRNA和蛋白质水平对转染正确性进行鉴定；采用TRAP-ELISA法和Southern blot检测转染细胞端粒酶活性及端粒长度变化；采用MTT法检测细胞生长曲线；采用流式细胞仪测定细胞周期；采用Western blot测定PCNA(增殖性细胞核抗原)、Id1(分化抑制因子)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达变化；从光镜及电镜水平观察转染细胞形态学改变；并通过染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验和流式细胞仪检测DNA倍体实<WP=8>验对hTERT基因转染细胞是否具有恶性表型进行分析。结果：(1)构建了含有hTERT基因的荧光真核表达载体。 (2)通过脂质体法，将hTERT荧光正义真核表达载体及空载体导入hEF细胞经G418筛选，各获一个阳性克隆，分别命名为hEF-hTERT和hEF-EGFP，并从DNA、mRNA和蛋白质水平鉴定外源性hTERT基因成功导入hEF细胞,并可转录及翻译。(3)hEF-hTERT细胞端粒酶活性明显高于hEF和hEF-EGFP细胞(0.290±0.040 vs 0.110±0.012,0.093±0.032,P<0.01)，端粒长度得到延长，分别为6.0kb、5.3kb和5.4kb。体外培养60代后，hEF、hEF-EGFP细胞出现生长减缓，而hEF-hTERT细胞在体外培养70代后仍能每2-3天传一代。(4)外源性hTERT转染对hEF细胞端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白1(TP1)在mRNA水平上的表达无影响。(5)MTT法显示,hEF-hTERT细胞增殖明显增快；蛋白免疫印迹检测发现，hEF-hTERT细胞PCNA、Id1、Ⅰ和Ⅲ型胶原表达明显增强；流式细胞仪测定细胞周期发现，hEF-hTERT细胞G0/G1期细胞数较hEF和hEF-EGFP细胞下降，S期和G2M期细胞数升高，增殖指数(PI)增高；透射电镜下hEF-hTERT细胞中线粒体、粗面内质网等细胞器较hEF和hEF-EGFP细胞丰富。(6)核型分析显示hEF-hTERT细胞染色体数目为46条；流式细胞仪检测DNA未出现异倍体；将hEF及其转染细胞接种到裸鼠皮下,均不产生致瘤性。结论：本研究成功构建了携带hTERT全长cDNA序列的荧光真核表达载体hTERT-pIRES2-EGFP，并将其稳定转染至人胚胎成纤维细胞中，使细胞端粒酶得到活化，端粒长度延长，从而使细胞寿命延长，细胞增殖能力得到明显增强，并且转染细胞不产生恶性表型。