研究背景与目的血管生成在胃肠道肿瘤发生和转移过程中起到至关重要的作用,包括结肠癌、胃癌、肝癌、胆管癌等的发生和转移。在已知存在众多血管生成因子中,血管内皮生长因子（VEGF-A）和组胺（Histamine）被广泛认为是两种最重要的成员,前者其不但活性强,而且对血管内皮上表达的VEGFR-1、VEGFR-2以及神经毡蛋白受体具有一定选择性,并且几乎在所有的病理性血管生成中都高度表达,并且能影响血管生产中的多个环节。尽管人源的VEGF-A抗体阿瓦斯汀已经广泛用于临床的抗肿瘤治疗,且效果不错,但也存在明显的副作用。因此,迫切需要寻找一类能作用在VEGF-A下游靶位点的药物,以减少其副作用。组胺是一种在体内外实验中都具有重要作用的生物胺,参与急性炎症反应,也是中枢神经系统的一种重要递质。组胺在哺乳动物组织的神经元、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、胃壁细胞以及许多癌细胞中都有广泛的表达。组胺的活性由4种G蛋白偶联的受体（H1-H4）介导,且这些受体在不同组织中有不同的分布。H1受体的分布最为广泛,除了能介导中枢神经系统的功能调节外,还参与超敏反应,在这些反应中,组胺从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中被释放出来,对血管平滑肌细胞具有强烈的收缩作用,进而引起细胞的收缩和分裂,而在内皮细胞则会诱导微血管的通透性的增加,甚至内皮细胞的分裂。H2受体也参与了神经递质的传递,此外还参与胃酸的分泌和T淋巴细胞的功能,而H3则主要介导神经递质的传递。最近又有研究发现,H4还在造血系细胞上有表达并介导炎性细胞的趋化,细胞因子释放和T淋巴细胞活化等功能。TR3/Nur77属于转录因子家族的核受体IV亚家族,该家族受体有三个成员（包招Nur77, NOT1/Nurr1和NOR1）,都包含3个功能区：反式激活区、DNA结合区以及配体结合区。他们的DNA结合区高度同源,但反式激活区差异较大。由于其序列与其他受体如T细胞受体之间的高度同源性,因此在T细胞介导的凋亡和棕色脂肪产热过程中也发挥重要作用。但在胚胎的发育中,这三种受体的作用却大不相同。最近研究显示,TR3/Nur77还是血管生成过程中的一个重要介质,与微血管通透性有关。体内和体外实验均显示,TR3/Nur77在VEGF-A,组胺和五羟色胺等能导致微血管通透性增加的促血管生成因子刺激下,可以发生一过性高表达,并导致微血管通透性增加,但是其他不能引起微血管通透性增加的血管因子则没有该作用。TR3/Nur77还参与后天的血管生成。还有研究显示,TR3/Nur77对VEGF-A,组胺和五羟色胺诱导的内皮细胞的增殖,迁移,存活以及微管形成都是不可缺少的。在Nur77基因敲除的小鼠中,VEGF-A,组胺和五羟色胺对肿瘤生长,血管生成和微血管通透性的诱导作用都明显下降。但Nur77敲除小鼠不但可以存活,繁殖,并且其成年鼠的血管结构也基本正常。这些研究显示,TR3/Nur77对病理性血管生成是不可或缺的,但对于生理性血管生成以及生长发育却没有明显影响。然而,VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用和信号通路尚不明确,本研究对此作用及其分子机制进行了初步探讨。研究通过实时定量PCR、RNA干扰以及免疫印迹等实验方法,检测了VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导和信号通路,并借助免疫印迹以及免疫共沉淀方法,检测与TR3/Nur77表达密切相关通路中蛋白质表达水平的变化,进一步探讨了VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达诱导可能的分子机制。第一部分VEGF-A以及组胺对TR3/Nur77表达的诱导作用研究目的1、明确TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在及其结构差别；2、检测VEGF-A和组胺对TR3三种转录变异体表达的影响；3、检测其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响。研究方法1、在Genebank数据库进行检索查找TR3基因编码的3种转录变异体信息,比对其内含子外显子区别,并设计特异性的实时定量PCR引物序列；2、用实时定量PCR和免疫印迹技术确认TR3三种转录变异体的存在和差异性的表达；3、应用实时定量PCR明确其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体在不同细胞系中表达的影响；4、实验根据情况采用非对称t检验,和Mann - Whitney检验来进行统计学显著性的检查。p<0.05为差异有统计学意义。结果1、TR3三种转录变异体的Genebank数据库信息及结构和实时定量PCR引物序列TR3基因位于第12对染色体上（NC₀00012.12）,Genebank数据库收录的mRNA转录变异体有3个,分别为TR3转录变异体1（TR3-TV1）、TR3转录变异体2（TR3-TV2）和TR3转录变异体3（TR3-TV3）。TR3-TV1由外显子3-10构成,缺失外显子1和外显子2,；TR3-TV2则由外显子3和外显子5-10构成,缺失外显子1,2和4；而TR3-TV3则由外显子1,2以及外显子5-10构成,缺失外显子3和4。TR3-TV1和TR3-TV2均编码相同的59.8KDa大小的TR3-异构体1（TR3-iso1）蛋白；而TR3-TV3的产物为61.2KDa大小的TR3-异构体2（TR3-iso2）蛋白,该蛋白比TR3-异构体1蛋白多了13个氨基酸。我们设计了能够特异性地对TR3的3种转录变异体进行扩增的实时定量PCR引物。所得到的PCR产物用DNA电泳胶进行分析,均通过DNA测序验证序列正确无误。2、TR3三种转录变异体在不同细胞系中的存在和差异性的表达这三种TR3转录变异体在细胞内的表达水平不同,在HUVEC和HDMVEC中都是TR3-TV1表达最低,而TR3-TV3的表达最高。我们进一步对VEGF-A刺激下三种TR3转录变异体的表达情况进行了研究。在HUVEC细胞中TR3-TV1, TV2和TV3的表达分别被诱导升高了约2倍,100倍和5倍,而在HDMVEC田胞中,VEGF-A对这3中变异体的诱导作用明显更高,分别达到100倍,400倍和20倍。而且VEGF-A对TR3-TV1和TR3-TV2诱导作用峰值出现在1小时时,而对TR3-TV3诱导作用的峰值出现在2小时时（图1D）。VEGF的另一个家族成员VEGF-Al21以及另一血管生成因子Histamine对HUVEC细胞TR3转录变异体的影响与VEGF-A类似,都已刺激TR3-TV2表达上调为主,而组胺的刺激作用更强。我们还特制了针对TR3-iso2上N末端前13个氨基酸序列的抗体,并用其对HUVEC和HDMVEC细胞裂解液进行免疫印迹检测。发现,经VEGF-A刺激的HUVEC和HDMVEC中TR3-iso2蛋白水平明显升高。TR3-iso1和TR3-iso2的共同抗体（TR3-iso1&2）也有类似结果。但是,在HDMVEC的细胞裂解液中存在多条TR3条带,暗示其中的TR3发生高度磷酸化。我们的数据显示,在内皮细胞中存在TR3转录变异体,且这些TR3转录变异体在VEGF-A/Histamine的刺激下表达上调程度有所差异。3、其他炎性因子如TNF-a, PMA, LPS和CHX和生长因子如EGF对TR3各个转录变异体表达的影响我们对HUVEC细胞,人结肠肿瘤细胞HCT116、人前列腺癌肿瘤细胞PC3和LnCap用生长因子EGF或炎性因子TNF-a, PMA, LPS和CHX进行刺激,发现,在接受生长因子EGF刺激下这些细胞的TR3的这三种转录变异体均有一定程度升高,以TR3-TV2表达上调最为明显,且峰值出现在1小时。其他炎性因子也可刺激这些细胞内TR3转录变异体的上调,其中PMA可刺激HUVEC细胞的TR3-TV2在一小时的时间点上上调400多倍,而炎性因子CHX则主要诱导HUVEC的TR3-TV3表达上调,且增高可达30余倍。这表明,TR3的这三种转录变异体广泛存在于这些细胞内,并且在受到不同的炎性因子和生长因子刺激时,表达可以有不同程度的上调。结论1、TR3存在三种转录变异体,且这三种转录变异体的表达存在差异性；2、VEGF-A和组胺对TR3转录变异体的表达有很强的刺激作用,且均以TR3-TV2表达上调最为明显；3、TR3三种转录变异体也存在于其他肿瘤细胞系中,且不同的炎性因子和生长因子对其表达的影响不同；VEGF-A和组胺对TR3/Nur77表达诱导作用的分子机制研究目的1、检测参与介导VEGF-A和组胺对TR3转录变异体转录影响的可能信号通路。2、检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响,并确定参与VEGF-A诱导TR3转录上调的VEGF受体类型。3、检测IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。4、检测介导组胺诱导的TR3转录上调的受体类型以及IGF-1R对组胺诱导的TR3转录上调的影响。研究方法1、实时定量PCR方法检测多条常见信号通路抑制剂和shRNA对VEGF-A和组胺诱导TR3转录变异体转录的影响。2、实时定量PCR方法检测VEGF家族不同成员对TR3转录变异体转录的影响,并用免疫印迹方法检测VEGF下游MAPK表达情况。3、用VEGF和EGF受体嵌合体系统对参与VEGF诱导TR3转录上调的VEGF受体类型继续确认,并检测其下游MAPK的表达。4、加入IGF-1R特异性抑制剂和shRNA后,观察IGF-1R在VEGF-A诱导的TR3转录上调过程中的作用。5、用免疫印迹方法检测VEGF对IGF-1R磷酸化的影响,并用免疫共沉淀方法检测KDR与IGF-1R的相互作用。6、用特异性组胺受体抑制剂研究介导组胺诱导TR3转录避变异体的受体类型,并探讨IGF-1R对该通路的影响。结果1、参与调节VEGF-A诱导TR3转录变异体表达的信号通路我们用三种转录变异体特异性的引物对VEGF-A刺激下的TR3-TV2和TR3-TV3调节通路予以了研究。发现：BAPTA/AM（一种能抑制细胞内Ca2+释放的抑制剂）和环孢菌素-A（一种钙调磷酸酶抑制剂）几乎能完全阻断VEGF-A对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用。而钙调素拮抗剂W-7以及CaM激酶Ⅱ抑制剂KN62则对VEGF-A的该作用几乎没有影响。而且,PLC抑制剂U-73122, PLC显性失活对照（PLC-DN）, PKC抑制剂GF109203X,经PMA处理的PKC表达下调,PKCδ显性失活突变体（PKCδ-DN）, PKD抑制剂（CID2011756）,PKD异构体1shRNA （shPKD）,和MEK抑制剂（PD98059）,IκB shRNA （shIκB）,p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂Ⅱ都几乎能完全抑制VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调。而PI-3激酶抑制剂以及P13K和Akt的显性失活突变体则对VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达几乎没有影响。这些数据表明,Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路,NF-κB通路以及MAP激酶（ERK, p38和JNK）通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用,而PI3K-Akt通路则没有参与该过程的调节用。2、参与调节组胺诱导TR3转录变异体表达的信号通路对组胺诱导TR3转录变异体表达调节的信号通路研究发现：BAPTA/AM和环孢菌素-A几乎能完全阻断组胺对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用。而钙调素拮抗剂W-7以及CaM激酶Ⅱ抑制剂KN62则对该作用几乎没有影响。而且,PLC抑制剂U-73122,PLC显性失活对照（PLC-DN）, PKC抑制剂GF109203X,经PMA处理的PKC表达下调,PKCδ显性失活突变体（PKCδ-DN）, PKD抑制剂（CID2011756）, PKD异构体shRNA （shPKD）,和MEK抑制剂（PD98059）,都几乎能完全抑制组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调。而PI-3激酶抑制剂,PI3K和Akt的显性失活突变体,IκB shRNA（shIκB）,p38抑制剂SB203580以及JNK抑制剂Ⅱ则对组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达几乎没有影响。我们的数据表明,Ca2+-PLC-PKC-PKD1通路,以及MAP激酶（ERK）通路在组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达发挥关键性作用,而PI3K-Akt通路和NF-κB通路则没有参与该过程的调节用。3. VEGF家族其他成员对TR3-TV2和TR3-TV3表达的诱导作用我们还对VEGF-A诱导TR3转录变异体表达时起作用的4种VEGF受体类型进行了进一步的验证。VEGF-A与VEGFR1/Flt-1, VEGFR2/KDR,申经毡蛋白1（NP-1）以及神经毡蛋白2（NP-2）都能结合,VEGF-B和P1GF仅能与VEGFR1/Flt-1, NP-1和NP-2发生相互作用,而VEGF-E则仅能够与VEGFR2/KDR发生相互作用。我们还发现,VEGF-A和VEGF-E可以同时上调TR3-TV2和TR3-TV3的表达,而VEGF-B和P1GF则对两者都没有作用。这些数据显示,VEGFR2/KDR介导了VEGF-A刺激下TR3-TV2和TR3-TV3上调,而VEGFRl/Flt-1, NP-1或者NP-2都不起作用。我们还对HUVEC细胞予以VEGF-A+VEGF-B, VEGF-A+P1GF, VEGF-E+VEGF-B和VEGF-E+P1GF进行刺激,结果显示,尽管VEGF-B或者P1GF都可以导致MAPK的磷酸化,但对于VEGF-A或者VEGF-E所诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达上调没有影响。这些数据表明,VEGFR2/KDR,而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。4、VEGF嵌合受体无法导致TR3-TV2的高表达我们将HUVEC细胞分别单独或联合转染蛋白嵌合受体,并以EGF取代VEGF-A对细胞进行刺激,这样,每个受体的传导通路都被分别开来。所得的数据显示：与对照组相比相比,经转染EGDR的HUVEC细胞中,EGF仅能诱导TR3-TV2mRNA表达上调15倍作用,比VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染细胞低75%,而EGF诱导的TR3-TV3为5倍左右,与VEGF-A或者VEGF-E诱导的非转染HUVEC细胞类似。而且与EGDR一起联合转染EGLT或EGNP-1对EGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3几乎没有影响。随之,我们对实验中所使用的该EGF-EGDR系统通过特异性的MAPK磷酸化抗体的免疫印迹分析进行了有效性验证。这些数据显示,除了VEGFR2/KDR外,应该还有其他受体参与了VEGF-A诱导的TR3-TV2高表达。5、IGF-1R对VEGF-A刺激下的TR3-TV2表达的影响我们对HUVEC细胞予以VEGFR2/KDR激酶抑制剂SU1498, IGF-1R激酶抑制剂AG1024处理后,或者进行转染shKDR或者shIGF-1R2后,予以VEGF-A刺激,实时定量PCR数据显示,AG1024和shIGF-1R2能显著性抑制TR3-TV2的表达上调,但对TR3-TV3的表达没有影响,而shKDR几乎能同时完全抑制VEGF-A所诱导的TR3-TV2和TR3-TV3两种变异体的表达。虽然SU1498能增加TR3-TV2的表达,但对TR3-TV3的表达却没有影响。综合所有这些数据,我们发现VEGFR2/KDR介导了VEGF-A所诱导的TR3-TV3表达,而VEGFR2/KDR或者EGDR仅能介导VEGF-A所诱导的低水平的TR3-TV2表达,高水平的TR3-TV2表达则需要另一种受体-IGF-1R的共同参与。我们还发现,IGF-1R不参与VEGF-A诱导的MAPK磷酸化过程。6、VEGF-A所诱导的IGF-1R磷酸化以及其与VEGFR2/KDR的交联作用我们进一步对IGF-1R调节VEGF-A诱导TR3变异体表达的信号通路进行了研究。HUVEC细胞经血清饥饿后予以VEGF-A, VEGF-B, VEGF-E和P1GF刺激,之后提取细胞裂解液用特异性的IGF-1Rβ抗体进行免疫印迹研究。研究发现,VEGF-A和VEGF-E能诱导IGF-1R磷酸化,但VEGF-B或者P1GF却没有该作用,而且VEGF-A导致的IGF-1R磷酸化可以完全被KDR的沉默RNA-shKDR所抑制,但KDR的另一种化学抑制剂SU1498或IGF-1R的化学抑制剂AG1024则没有该作用,并且EGF也不能在EGDR转染HUVEC中诱导该效应。我们随之用特异性的VEGFR2/KDR或者IGF-1Rα抗体进行免疫共沉淀发现,VEGF-A刺激后,在VEGFR2/KDR抗体的免疫共沉淀物中检测到磷酸化的IGF-1Rβ和IGF-1Rα,而在IGF-1R抗体的免疫共沉淀物中则检测到了VEGFR2/KDR.这些数据表明,VEGF-A能够诱导VEGFR2/KDR和IGF-1Rα/IGF-1Rβ的物理学相互作用。7、参与组胺诱导的TR3转录变异体表达的受体类型及IGF-1R对该过程的影响我们对经血清饥饿处理的HUVEC细胞分别用H1,H2和H4特异性的阻断剂处理后,发现TR3-TV2的转录刺激主要由H1受体介导,而TR3-TV3的转录上调则由H1和H4共同介导。此外,我们还发现IGF1-R的特异性化学阻断剂AG1024和shRNA均可以下调组胺对TR3转录的刺激,表明IGF1-R在组胺刺激的TR3转录上调过程中有一定作用。但在免疫印迹研究中,我们发现,组胺并不诱导IGF1-R的磷酸化,但AG1024可以一定程度上抑制组胺导致的ERK磷酸化。这些结果表明,组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导,并且受体IGF1-R似乎也对这一通路有一定影响,但具体机制尚不明确。结论1、钙PLC-PKC-PKD1通路和NF-κB通路和MAP激酶（ERK, p38和JNK）通路在VEGF-A诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达中都起到重要作用；而组胺诱导的TR3-TV2和TR3-TV3mRNA表达则主要由钙PLC-PKC-PKD1通路介导。2、VEGFR2/KDR,而非VEGFR1/Flt-1或者神经毡蛋白介导了VEGF诱导的TR3-TV2和TR3-TV3表达。3、VEGF-A和VEGF-E可以诱导胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）的磷酸化,并促成其与VEGF受体2（KDR）发生交联,进而导致TR3-TV2的高表达。4、组胺通过其受体H1和H4介导对TR3转录的诱导,并且受体IGF-1R对这一通路的传导有一定影响。